目的:在急慢性肝脏疾病过程中,胆管反应（ductularreaction,DR）的种类及其作用究竟是保护肝脏还是促进肝纤维化的进展并不是十分明确。研究报道胆管反应的种类、细胞来源和作用可能取决于肝脏损伤类型或动物模型种类。Hedgehog信号通路在肝纤维化发生发展中发挥着重要作用,但其在肝纤维化病理过程中肝祖细胞（hepatic progenitor cells,HPCs）增殖、分化与DR中的作用机制尚不清楚,对其进行较系统的探析可能发展抗肝纤维化治疗的新途径。课题组前期质谱分析发现,绞股蓝总皂苷（Gypenosides,GPs）作为扶正化瘀方（Fuzheng Huayu,FZHY）的有效成分之一,在大鼠口服后FZHY后发现其血浆中含有GPs成分;且GPs具有显著改善肝纤维化的作用,但其抗肝纤维化的作用机制并未解明。本研究探讨肝祖细胞发生DR在肝纤维化发生发展过程中的作用及作为Hedgehog信号通路的主要转录因子Gli1对其影响以及GPs的干预效应机制。方法:1、采用3种肝纤维化模型观察HPCs发生DR在肝纤维化进展过程中的作用:①采用30%四氯化碳（carbontetrachloride,CCl4）/橄榄油溶液皮下注射Fisher 344大鼠制备肝纤维化模型（2mL/kg体重,每周两次）,第7周开始,模型组大鼠分为单纯CC14组（CC14组）、CCl4联合二乙酰氨基芴（2-acetylaminofluorene,2-AAF）组（CCl4/2-AAF 组）,CCl4/2-AAF 组在予以 2-AAF 灌胃（10mg/kg/d）的同时,继续予以30%CC14/橄榄油溶液皮下注射,9周末处死取材;②大鼠胆管结扎（bile ductligation,BDL）胆汁性肝纤维化模型,造模4周后处死取材;③原发性硬化性胆管炎模型（Mdr2-/-）小鼠模型,Mdr2-/-小鼠由于缺乏管状磷脂转位酶、胆汁中没有磷脂可自发形成肝损伤从而导致原发性硬化性胆管炎,6周末处死取材。用苏木素-伊红（haematoxylin-eosinstaining,H＆E）染色法评估肝组织炎症情况,天狼猩红（siriusredstaining,SR）染色检测肝组织胶原沉积,并作胶原纤维面积比半定量分析,碱水解法检测肝组织中羟脯氨酸（hydroxyproline,Hyp）的含量;采用qRT-PCR、Western blot以及免疫组织化学染色法检测肝组织中肝纤维化指标（α-SMA、Col I、Col Ⅳ）、肝祖细胞标志物（Epcam、OV6、Sox9）、胆管上皮细胞标志物（CK19、CK7）、细胞增殖指标（Ki67）、Hedgehog信号通路相关蛋白的表达水平;免疫荧光染色法观察OV6与CK19、CK7的共表达情况。2、Gli1蛋白对肝纤维化大鼠DR的影响:①采用CCl4/2-AAF肝纤维化大鼠模型,从第7周开始,分别予Gli1蛋白的小分子抑制剂GANT61（25mg/kg体重,隔天一次,灌胃）、以及TNFα的抑制剂泊马度胺（Pomalidomide,P）（0.25mg/kg体重,一天一次,腹腔注射）干预;9周末处死取材。②采用BDL肝纤维化大鼠,造模后一周给予GANT61（25mg/kg体重,隔天一次,灌胃）,4周末处死取材。用Real Time PCR、Western blot检测体内肝组织中Gli1及TNFα的表达水平;qRT-PCR、Westernblot以及免疫组织化学染色法检测α-SMA、Col Ⅰ、Col Ⅳ、Epcam、OV6、Sox9、CK19、CK7、Ki67以及Hedgehog信号通路其他相关指标的表达水平,免疫组织荧光染色法观察OV6与CK19、CK7的共表达情况;H＆E染色法评估肝组织炎症变化,SR染色检测肝组织胶原沉积情况,并进行胶原纤维面积比半定量分析,测定肝组织中Hyp含量。结合体外实验采用3.75μM 丁酸钠（sodium butyrate,SB）诱导WB-F344细胞（肝祖细胞株）向胆管上皮细胞表型分化模型,分别予GANT61和泊马度胺干预;转染Gli1基因干扰慢病毒载体和Gli1基因过表达慢病毒载体,qRT-PCR、Westernblot以及细胞免疫荧光染色法观察细胞CK19、Gli1、TNFα及Hedgehog信号通路其他指标的表达情况。3、GPs对肝纤维化大鼠肝组织DR的影响:①采用CCl4/2-AAF肝纤维化大鼠模型,从第7周开始,给予GPs干预,分别以FZHY和GANT61为阳性对照,9周末处死取材。②采用BDL胆汁性肝纤维化大鼠模型,在造模后一周予GPs干预,4周末处死取材。H＆E染色法评估肝组织炎症情况,SR染色检测肝组织胶原沉积,并作胶原纤维面积比半定量分析,测定肝组织中Hyp含量;qRT-PCR、Westernblot以及免疫组织化学染色法检测α-SMA、Col Ⅰ、Col Ⅳ、Epcam、OV6、Sox9、CK19、CK7、Gli1、TNFα、Ki67以及Hedgehog信号通路其他相关指标的表达水平,组织免疫荧光染色法观察OV6与CK19的共表达情况。结合体外实验采用丁酸钠诱导WB-F344细胞向胆管上皮细胞表型分化模型,分别给予GPs、FZHY和GANT61干预,qRT-PCR、Western blot以及细胞免疫荧光染色法检测CK19、CK7、Gli1、TNFα、Ki67以及Hedgehog信号通路其他相关指标的表达水平。同时体外WB-F344细胞转染Gli1基因过表达慢病毒载体,并用丁酸钠诱导WB-F344细胞向胆管上皮细胞表型分化,予以GPs和FZHY干预,qRT-PCR、Western blot以及细胞免疫荧光染色法检测CK19、CK7、Gli1、TNFα、Ki67以及Hedgehog信号通路其他相关指标的表达水平。结果:1、HPCs发生DR在肝纤维化进展过程中的作用:①在CCl4/2-AAF肝纤维化大鼠模型中,免疫组织化学染色显示,CCl4/2-AAF组OV6和Epcam的阳性细胞主要位于纤维间隔内,成假胆管样结构,假小叶内也可见大量的OV6和Epcam阳性细胞,且Epcam阳性细胞同时也表达Ki67,对所有大鼠肝组织切片行全片扫描及半定量分析,发现CCl4/2-AAF组中Epcam的阳性细胞数显著高于单纯CC14组（P＜0.01）;免疫组织荧光染色显示,几乎所有OV6阳性细胞均表达CK19,与单纯CC14组相比,CCl4/2-AAF组肝组织CK19与OV6共表达的阳性细胞数明显增多,α-SMA以及ColI阳性细胞包绕着OV6阳性细胞,且α-SMA以及Col Ⅰ阳性细胞数量较单纯CCl4组显著增多;H＆E染色显示,单纯CCl4组肝小叶结构紊乱,伴有大量肝细胞脂肪变性,而CCl4/2-AAF组肝组织脂肪变性减少,纤维间隔内大量炎性细胞浸润;SR染色结果显示,在CC14-橄榄油溶液皮下注射的第6周,大量胶原纤维沉积,形成不完整的假小叶结构,提示6周末已形成肝纤维化,9周末形成部分完整的纤维间隔,但胶原纤维较细,提示早期肝硬化形成;CCl4/2-AAF组肝组织纤维间隔增粗增宽,甚至深入到假小叶内,对SR染色半定量分析发现CCl4/2-AAF组中胶原阳性面积较单纯CCl4组显著增加（P＜0.05）;与单纯CCl4组相比,CCl4/2-AAF 组 Hyp 含量显著增加（P＜0.01）;Sox9、Epcam、Ki67、Ccnd 1、CK19、CK7、Col I 和 Col Ⅳ 的 mRNA 表达显著增高（P＜0.01、P＜0.05）;CK19和α-SMA的蛋白表达显著增多（P＜0.05）;Hh信号通路相关因子Gli1、Dhh、Ptch2和Gli2的mRNA表达明显上调（P＜0.01、P＜0.05）。②在BDL胆汁性肝纤维化大鼠模型中,与假手术组相比,BDL组H＆E染色可见肝细胞坏死,炎性细胞浸润,胆管细胞增生;SR染色可见大量异常新生胆管;α-SMA、Col Ⅰ、CK19、CK7、Epcam、OV6以及Ki67的mRNA和蛋白表达明显上调（P＜0.01、P＜0.05）;Gli1、Dhh、SMO、Gli2、Gli3 以及 TNFα 的 mRNA 表达显著增高（P＜0.01、P＜0.05）。③Mdr2-/-原发性硬化性胆管炎模型中,与Mdr2+/+野生型小鼠相比,Mdr2-/-模型组小鼠肝组织 α-SMA、Col Ⅰ、Col Ⅲ、ColⅣ、TGF-β1、Epcam、CK19 以及CK7 的 mRNA 表达显著增高（P＜0.01、P＜0.05）;α-SMA、Epcam、CK19 以及CK7的蛋白表达明显增加。进一步研究发现肝组织Gli1、SMO、Ptch2、Gli2以及TNFαmRNA表达显著增高（P＜0.01）;Gli1和TNFα蛋白表达明显增多。2、Gli1抑制剂GANT61对CCl4/2-AAF与BDL模型大鼠的干预作用:①在CCl4/2-AAF肝纤维化模型大鼠模型中,与CCl4/2-AAF组相比,GANT61组和泊马度胺组肝组织H＆E染色显示炎性细胞浸润减少;SR染色胶原沉积明显减少,SR染色半定量分析发现胶原阳性面积显著减少（P＜0.05）;免疫组织化学染色显示OV6、Epcam、Ki67、CK19、CK7和α-SMA阳性细胞数明显减少;免疫组织荧光共染结果显示共表达OV6与CK19以及OV6与CK7阳性细胞数显著减少;Epcam、Ki67、CK19、CK7、ColⅠ、ColⅣ 以及 α-SMA 的 mRNA 表达明显下调（P＜0.01、P＜0.05）;CK19和α-SMA蛋白表达显著减少（P＜0.05）;有趣的是,与CCl4/2-AAF组相比,泊马度胺组肝组织Gli1的mRNA表达无显著变化（P＞0.05）,而GANT61组肝组织TNFα的mRNA和蛋白表达显著下调（P＜0.05,P＜0.01）。（2）在BDL胆汁性肝纤维化模型大鼠中,与BDL模型组相比,GANT61组肝组织H＆E染色显示异常增生的胆管数量显著减少,炎性细胞浸润改善;SR染色胶原纤维明显减少,纤维间隔变细;免疫组织化学染色显示OV6、CK19、CK7以及α-SMA阳性细胞数量显著减少;免疫组织荧光共染显示共表达OV6与CK19、OV6与CK7的阳性细胞数明显减少;且Gli1、CK19、Ptch2、SMO、ColⅠ、ColⅣ以及α-SMA的mRNA表达显著下调（P＜0.05、P＜0.01）;CK19和Epcam的蛋白表达也显著减少。3、WB-F344细胞体外实验:与对照组相比,丁酸钠组细胞CK19的mRNA和蛋白表达显著增多（P＜0.01）;G1i1、Dhh和TNFα的mRNA表达显著上调（P＜0.01）,提示Gli1参与了 WB-F344细胞向胆管上皮细胞表型分化的过程。采用GANT61干预WB-F344细胞分化过程发现,与丁酸钠组相比,GANT61组Gli1、CK19、Dhh、Ptch2 和 Ki67 的 mRNA 表达显著减少（P＜0.01、P＜0.05）;CK19、Gli1以及TNFα的蛋白表达量明显减少。经预实验摸索采用MOI=50条件将WB-F344细胞转染Gli1基因干扰慢病毒,绿色荧光观察显示,慢病毒转染效率达80%以上,Gli1的mRNA表达较空载病毒组下降了 73.6%;WB-F344细胞转染Gli1干扰慢病毒后,与丁酸钠+空载慢病毒组相比,丁酸钠+Gli1干扰慢病毒组细胞Gli1、CK19、Ki67、Ccnd1 和 TNFα 的 mRNA 显著下调（P＜0.01、P＜0.05）;细胞免疫荧光显示丁酸钠+Gli1干扰慢病毒组表达Gli1阳性细胞数较丁酸钠+空载慢病毒组显著减少。同样用MOI=50条件将WB-F344细胞转染Gli1基因过表达慢病毒,绿色荧光观察显示,慢病毒转染效率达90%以上,单一 Gli1过表达慢病毒组Gli1的mRNA表达较空载慢病毒对照组显著升高（P＜0.01）;WB-F344细胞过表达Gli1基因后,与空载病毒对照组相比,单一 Gli1过表达慢病毒组Gli1、TNFα以及Ptch2的mRNA表达显著升高（P＜0.01）,CK19的mRNA和蛋白表达显著上调（P＜0.01）;与丁酸钠+空载慢病毒组相比,丁酸钠+Gli1过表达慢病毒组Gli1、TNFα以及Ptch2的mRNA表达明显升高（P＜0.01）,CK19的mRNA和蛋白表达显著增多（P＜0.01）。采用泊马度胺干预WB-F344细胞后,与丁酸钠组相比,泊马度胺组细胞TNFα、CK19的mRNA和蛋白表达显著下调（P＜0.01）。有趣的是,抑制Gli1的表达后,TNFα的mRNA和蛋白表达显著下降,过表达Gli1后,TNFα的mRNA表达显著上调;而抑制TNFα的表达后,Gli1的表达则无显著变化（P＞0.05）,这与体内结果一致。4、GPs干预CCl4/2-AAF与BDL肝纤维化模型大鼠以及WB-F344细胞向胆管上皮细胞表型分化的作用机制:①在CCl4/2-AAF肝纤维化模型大鼠中,H＆E和SR染色结果显示,与CCl4/2-AAF组相比,GPs组、FZHY组和GANT61组炎性细胞浸润均有不同程度的减轻,胶原沉积减少;SR染色半定量分析显示胶原阳性面积比均显著减少（P＜0.01、P＜0.05）;免疫组织化学染色结果显示,三组治疗组肝组织ColI、Col Ⅳ、α-SMA、OV6、Epcam、CK19和CK7阳性细胞数量显著减少;Epcam、CK19、Gli1 和 Ptch2 的 mRNA 表达显著下调（P＜0.05、P＜0.01）,FZHY组和GANT61组ColⅣ的mRNA表达显著下调（P＜0.05）,GPs组和FZHY组肝组织Dhh和SMO的mRNA表达明显下降（P＜0.01、P＜0.05）;三组治疗组中CK19、α-SMA和TNFα蛋白表达显著下调。②在BDL肝纤维化大鼠中,与BDL模型组相比,GPs组H＆E染色结果显示新生胆管数量减少,炎性细胞浸润减轻;SR染色显示胶原沉积减轻;免疫组织化学染色显示,α-SMA、Desmin、OV6、Epcam、CK19 和 CK7 阳性细胞数量显著减少;α-SMA、Col Ⅰ、Col Ⅳ、SOX9、Epcam、CK19、CK7、Ki67、Ccnd1 和 TNFα 的 mRNA 表达明显下降（P＜0.01、P＜0.05）。体外实验显示,GPs和FZHY均可显著抑制WB-F344细胞向胆管上皮细胞表型分化,其中GPs以75μg/mL为最佳浓度,FZHY方以100μg/mL浓度最佳。与丁酸钠模型组相比,GPs组、FZHY组和GANT61组CK19、Gli1的mRNA和蛋白表达显著降低（P＜0.01）。与单一 Glil过表达慢病毒组相比,Gli1过表达慢病毒+GPs组和Gli1过表达慢病毒+FZHY组细胞Gli1和CK19的mRNA表达显著降低（P＜0.01、P＜0.05）;与丁酸钠+Gli1过表达慢病毒组相比,丁酸钠+Gli1过表达慢病毒+GPs组细胞Gli1、CK19和Ptch2的mRNA表达显著下调（P＜0.01）,丁酸钠+Gli1过表达慢病毒+FZHY组细胞CK19和Ptch2的mRNA表达也明显下调（P＜0.01、P＜0.05）。结论:1、肝纤维化进展阶段,HPCs活化、增殖、分化为胆管上皮细胞发生DR促进肝纤维化的进展;2、Gli1介导HPCs活化、增殖、发生DR,促进HPCs和胆管上皮细胞分泌TNFα,TNFα又进一步促进HPCs发生DR,加重肝纤维化进展;3、GPs通过下调Gli1的表达抑制HPCs细胞活化、增殖以及DR的发生,进而减轻肝纤维化。