论文部分内容阅读
目的观察半夏泻心汤及其不同配伍药组对抗生素诱导的肠道菌群失调幼鼠肠道菌群多样性的调整作用及结肠黏膜免疫屏障损伤的保护作用及机制。进一步根据中医“以方测证”理论,比较半夏泻心汤及其不同配伍药组的干预效应差异,探讨抗生素诱导的肠道菌群失调幼鼠结肠黏膜免疫屏障受损的中医证候特征,以期为临床开展中医药防治抗生素相关性胃肠道疾病提供思路及组方策略。方法选取3～4周龄健康SPF级雄性Balb/c幼鼠70只,随机分为空白组、模型组、阳性组、辛开组、苦降组、甘补组、半夏泻心汤全方组共7个组,每组10只。除空白组外,其余各组幼鼠均采用混合抗生素灌胃法建立肠道菌群紊乱模型,空白组等体积灌以生理盐水,连续灌胃14 d。造模完成后给予相应药物干预治疗,空白组与模型组以生理盐水灌胃,阳性组给予双歧杆菌四联活菌片干预,其余各组给予对应中药配伍药组干预治疗。连续给药14 d后无菌采集粪便样本用于16SrDNA测序分析肠道菌群,后经腹腔注射脂多糖（LPS）诱导炎性反应。HE染色观察结肠黏膜组织形态;甲苯胺蓝染色和免疫组织化学法分别观察结肠黏膜组织肥大细胞和巨噬细胞浸润情况;酶联免疫吸附试验（ELISA）测定粪便清蛋白表达水平;免疫印迹法（Western blot）检测结肠组织紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达水平;实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测炎性因子TNF-α、IL-10、IL-6、IL-8和IL-1βmRNA的表达情况。结果1.16SrDNA高通量测序:抗生素暴露后幼鼠肠道菌群的构成明显改变（P＜0.01）,与模型组比较,半夏泻心汤及其不同配伍药组均能增加肠道菌群相对丰度和物种多样性,升高Shannon、Chao1及Simpson指数,降低PD指数（P＜0.05,P＜0.01）。门水平上,以厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、变形菌门（Proteobacteria）为主。与空白组相比,模型组幼鼠厚壁菌门、拟杆菌门丰度减少（P＜0.01）,变形菌门丰度显著增加（P＜0.01）;与模型组比较,半夏泻心汤全方组及其不同配伍药组均能显著增加拟杆菌门（Bacteroidota）、厚壁菌门（Firmicutes）的丰度,降低变形菌门（Proteobacteria）丰度（P＜0.01）。属水平上,相对丰度较高的优势菌属为拟杆菌属（Bacteroides）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、乳杆菌属（Lactobacillus）、肠杆菌属（Enterobacter）等。与空白组比较,模型组中克雷伯氏菌属（Klebsiella）及肠杆菌属（Enterobacter）丰度显著增加,拟杆菌属（Bacteroides）、乳杆菌属（Lactobacillus）丰度显著降低（P＜0.05,P＜0.01）;与模型组比较,阳性组、半夏泻心汤及不同配伍药组均能显著降低克雷伯氏菌属（Klebsiella）及肠杆菌属（Enterobacter）等致病菌的丰度,增加拟杆菌属（Bacteroides）和乳杆菌属（Lactobacillus）的丰度,以辛开组、全方组最为显著（P＜0.05,P＜0.01）。2.HE染色:染色后观察,空白组结肠黏膜上皮染色均匀,组织结构清晰,腺体完整,上皮细胞排列整齐,隐窝无破坏,少量炎性细胞浸润和聚集;与空白组比较,抗生素暴露加LPS诱导刺激后,模型组肠黏膜损伤严重,腺体消失,基层可见大量的炎性细胞堆积;与模型组比较,各治疗组结肠黏膜层内隐窝结构损伤程度较轻,其中,以全方组肠黏膜最为完整,苦降组与甘补组无明显差异,辛开组效果较差。3.甲苯胺蓝染色:空白组幼鼠结肠黏膜组织内可见明显肥大细胞浸润,而模型组幼鼠结肠组织未见明显肥大细胞浸润;阳性组和半夏泻心汤全方组肥大细胞浸润较密集,辛开组、苦降组和甘补组三组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。4.免疫组织化学检测:模型组仅见个别F4/80标记的阳性细胞,较空白组显著减少,半夏泻心汤及其不同配伍药组幼鼠结肠黏膜组织内有大量F4/80标记的巨噬细胞的浸润,以半夏泻心汤全方组最优。各不同配伍药组比较,辛开组与甘补组F4/80阳性细胞光密度值无差别（P＞0.05）,苦降组优于以上两组。5.酶联免疫吸附试验（ELISA）:与空白组比较,模型组幼鼠粪便清蛋白含量显著增加（P＜0.01）;与模型组比较,阳性组、全方组、甘补组、苦降组幼鼠粪便清蛋白含量显著减少（P＜0.05,P＜0.01）,半夏泻心汤及其各不同配伍药组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。6.免疫印迹法（Western blot）:与空白组比较,抗生素暴露加LPS诱导刺激后模型组紧密连接蛋白Occludin及ZO-1表达水平降低（P＜0.01）;与模型组比较,阳性组、全方组及不同配伍药组幼鼠结肠组织ZO-1和Occludin蛋白表达显著升高（P＜0.05,P＜0.01）。半夏泻心汤及其各不同配伍药组组间比较发现,以全方组ZO-1蛋白的表达升高最为显著（P＜0.05,P＜0.01）;Occludin蛋白表达中全方组升高较各拆方配伍药组有统计学意义（P＜0.01）,甘补组与辛开组、苦降组比较差异无统计学意义。7.实时荧光定量PCR（RT-PCR）:与空白组比较,模型组幼鼠结肠组织炎性因子IL-1β、IL-6,IL-8、TNF-α和IL-10 mRNA表达均降低（P＜0.05,P＜0.01）。与模型组比较,半夏泻心汤及其不同配伍药组TNF-α、IL-6、IL-8的含量均明显增加（P＜0.01）。炎性因子总体表达情况以全方组和甘补组最为显著,辛开组显著性较低。其中,辛开组IL-1β、苦降组IL-10的mRNA表达较模型之间的差异无统计学意义。结论本研究证实了生命早期阶段过早的抗生素使用可诱导肠道菌群紊乱,进而诱发结肠黏膜免疫反应。半夏泻心汤及不同配伍药组能够调整抗生素暴露幼鼠肠道菌群结构,其中“甘补”及“辛开”配伍单元对于菌群平衡发挥核心作用,而在保护结肠黏膜病理损伤及改善免疫反应方面半夏泻心汤全方组更具显著优势。研究表明,抗生素诱导的肠道菌群紊乱幼鼠肠道菌群失调的中医病机与“虚”、“寒”有关,菌群紊乱所致肠粘膜免疫反应的病机则以“寒热错杂”为主要中医证候特征。