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聚γ-谷氨酸(γ-PGA)是一种生物高分子聚合物,不同分子量的γ-PGA因其性质不同,在食品、医药、环保、化妆品和农业等领域开发出不同的用途。然而,关于生物聚合物的可控合成研究进展缓慢。本论文针对地衣芽胞杆菌WX-02,系统开展γ-PGA降解酶基因的筛选确定、可控表达及发酵优化,以实现地衣芽胞杆菌高效合成不同分子量γ-PGA。在芽胞杆菌中,PgdS、γ-谷氨酰转移酶(GGT)和Cw1O被报道能够降解γ-PGA。首先,为探究这三种降解酶对地衣芽胞杆菌WX-02合成γ-PGA的影响,在地衣芽胞杆菌WX-02中分别构建ggt、cwl O、pgd S缺失和过表达菌株。摇瓶发酵结果表明,pgd S基因缺失菌株WX-02Δpgd S的平均分子量增加了32.00%(P<0.05),过表达pgd S使γ-PGA分子量降低92.20%(P<0.01)。然而缺失或过表达cwl O、ggt这两个降解酶基因对γ-PGA分子量和产量均无显著影响。上述结果表明PgdS是主要影响WX-02合成的γ-PGA分子量的降解酶。信号肽和启动子是影响胞外蛋白表达和分泌的两个关键因子。本研究为探究不同PgdS表达和分泌水平对γ-PGA分子量的影响。分别以8个信号肽(Sac C,Vpr,Bpr A,GGT,Apr E,PgdS,YvpA和Sac B)和4个启动子(P43,Pbac A,Pbpr A和Ppgd S)构建12种PgdS的表达载体,将上述构建的载体分别电转至地衣芽胞杆菌WX-02Δpgd S中,构建8株信号肽和4株启动子表达菌株。通过SDS-PAGE分析胞外PgdS含量发现,不同信号肽使得PgdS不同水平的表达,信号肽强度为SPsac B>SPyvp A>SPpgd S>SPapr E>SPggt>SPbpr A>SPvpr>SPsac C。根据SDS-PAGE和转录水平结果表明,启动子强度为P43>Ppgd S>Pbac A>Pbpr A。摇瓶发酵结果表明,12株工程菌产生不同分子量的γ-PGA,分子量分布为6.82×10~4-1.78×10~6 Da,比对照菌株γ-PGA分子量低14.2%-96.6%。表明通过调节PgdS的分泌能力和转录水平可以控制γ-PGA分子量,并获得不同分子量的γ-PGA。为进一步阐明PgdS表达水平与γ-PGA分子量之间的关系,选择不同强度启动子和信号肽进行组合表达PgdS,构建9株组合菌株,分别为SP41(p HYPbpr A-SPsac C)、SP45(p HYPbpr A-SPapr E)、SP48(p HYPbpr A-SPsac B)、SP31(p HYPbac A-SPsac C)、SP35(p HYPbac A-SPapr E)、SP38(p HYPbac A-SPsac B)、SP21(p HYPpgd S-SPsac C)、SP25(p HYPpgd S-SPapr E)、SP28(p HYPpgd S-SPsac B)。分别测定9株组合菌株PgdS酶活和蛋白含量,结果表明PgdS酶活性和表达量与启动子和信号肽强度成正相关,发酵结果表明,PgdS酶活/表达量越高,γ-PGA分子量越低。通过分析两种的相关性,皮尔逊相关系数为-0.983,表明γ-PGA分子量与PgdS表达水平呈明显负相关(P<0.01)。通过比较γ-PGA分子量和γ-PGA产量发现,γ-PGA产量随着分子量的降低而增加,皮尔逊相关系数为-0.988,P<0.01。为进一步分析降低γ-PGA分子量如何增加γ-PGA产量,我们比较了3株工程菌和对照菌株在1-L四联罐中的k _La和溶解氧(DO)。结果表明,分子量降低可以降低氧传质系数,增加了氧气和物质的传递速率,进而促进菌体代谢和γ-PGA的合成。最后,为了考察上述构建的一步法高效合成特定分子量γ-PGA的体系是否具有工业化生产的普适性。将3株重组地衣芽胞杆菌(SP12,SP14,SP18)在3-L发酵罐中发酵放大,发酵结果表明,所有工程菌γ-PGA的产量均高于对照菌,并且分子量均低于对照菌。其中SP18菌γ-PGA分子量为7.83×10~4Da,其最高产量达到39.13 g/L,γ-PGA产率为1.30 g/L/h,相比对照提高34.93%。相比其他谷氨酸非依赖菌株,利用该体系产生的γ-PGA生长效率最高。总之,我们通过调节PgdS的表达水平建立了一种有效的一步法生产特定分子量γ-PGA的系统,该系统不仅在工业上生产不同分子量γ-PGA具有巨大应用潜力,而且可以指导其他生物高分子聚合物不同分子量的合成。