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由于意外、摔伤和创伤等原因导致周围神经的功能或结构丧失,因此周围神经可能会受到损伤,从而导致感觉、自主和运动神经功能丧失或神经性疼痛。周围神经损伤是一种常见的能够导致健康机体功能缺失的神经性疾病,因此周围神经损伤后神经的再生与修复成为再生医学领域的热点研究。近几年,随着再生医学的迅速发展,外周神经的修复又重新焕发了希望,而种子细胞的选择是神经修复的先决条件和依据。脂肪干细胞(Adipose stem cells,ADSCs)通常是从机体生物的白色脂肪组织中提取出来的细胞,在37℃培养,能够迅速增殖,是再生医学领域中常见的种子细胞,通常用来修复机体损伤。然而,机体损伤后,损伤处机体内环境发生了一些的改变,可能会导致移植细胞的低存活率。因此,提高ADSCs在移植处存活率是提高其修复神经的重要环节。白藜芦醇(Resveratrol,Res)天然抗毒素,研究发现Res可以影响细胞的凋亡、分化和生长。本实验使用胶原酶消化法体外分离大鼠ADSCs,建立细胞凋亡模型,检测Res对ADSCs凋亡的影响,在将Res孵育后的ADSCs移植到神经损伤处,28 d后检测了大鼠坐骨神经修复效果。本实验分为三个部分:(1)建立脂肪干细胞凋亡模型取幼鼠腹股沟内脂肪,培养脂肪干细胞。传至第3代,诱导分化大鼠ADSCs。加入成脂诱导剂,14 d后,ADSCs中出现脂滴;加入成骨诱导剂,21 d后,ADSCs中的出现钙化结节。这说明采用酶消化法培养的ADSCs,是有分化能力。大鼠ADSCs生长至第3代,将完全培养基换成含有(0μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400μmol/L和500μmol/L)H2O2的完全培养基,诱导大鼠ADSCs发生凋亡,H2O2处理4 h。分析CCK-8的结果说明:H2O2浓度越高,细胞的存活率就越低。300μmol/L H2O2,4 h后,通过公式计算得到,细胞存活率为49.2%。TUNEL染色结果表明,与0μmol/L H2O2相比,300μmol/L浓度的H2O2 ADSCs凋亡率显著升高(P<0.05)。300μmol/L H2O2组Bax m RNA、Caspase-8 m RNA和Caspase-3 m RNA相对表达量与0μmol/L H2O2组相比显著提高,Bcl-2 m RNA相对表达量则显著降低(P<0.05)。通过分析实验结果,综合各项试验指标最后确定H2O2的浓度为300μmol/L。(2)白藜芦醇对H2O2诱导的大鼠ADSCs凋亡的影响第二部分探究了对H2O2诱导的大鼠ADSCs凋亡的影响,结果显示:Res单独(10,20,40,80和100μmol/L)作用与ADSCs 24 h对细胞的生存无显著影响。使用不同浓度的(10,20,40,80和100μmol/L)Res孵育大鼠ADSCs 24h后,再用300μmol/L H2O2作用4 h,检测细胞存活情况。CCK-8显示Res能提高ADSCs的存活率,且20μmol/L,24 h,效果更显著。Tunel染色结果表明Res+H2O2组的凋亡率与H2O2相比显著减少了30.23%(P<0.05)。q RT-PCR结果显示,与H2O2组相比,Res+H2O2组促凋亡相关的基因(Bax、Caspase-3)相对表达水平显著下调了0.98、0.81(P<0.05),Bcl-2 m RNA的相对表达量升高了0.92(P<0.05)。这些结果均表明20μmol/L Res孵育大鼠ADSCs 24 h后,ADSCs抗凋亡的能力提高。(3)白藜芦醇预处理ADSCs对大鼠坐骨神经再生的影响通过钳夹法,损伤大鼠坐骨神经。实验有4组(对照组,模型组,ADSCs组和ADSCs+Res组),每组13只实验大鼠。对照组仅注射PBS,模型组夹伤后注射PBS,ADSCs组夹伤后注射10μl的ADSCs细胞悬液,ADSCs+Res组夹伤后注射10μl的20μmol/L Res孵育24 h后的ADSCs细胞悬液。3个月后通过组织学染色、步态分析等方法进行神经再生评价。28 d后,大鼠步态结果显示,在术后各实验组坐骨神经功能指数均有一定的提高,在术后4w,模型组为-23.453,ADSCs组为-14.629,ADSCs+Res组为-9.846,ADSCs+Res组与ADSCs组比较,恢复较快(P<0.05),但均离对照组还有一定的距离。LFB染色结果可见ADSCs+Res组再生轴突纤维紧密排列,纤维均匀粗大,与对照组相似;而模型组神经轴突分布不均匀,密度较小。神经纤维髓鞘染色百分比由大到小依次是:对照组,ADSCs+Res组,ADSCs组,模型组。ADSCs+Res组免疫荧光S100/NF-200,S100/GFAP荧光强度均高于ADSCs组;腓肠肌结果显示,ADSCs组和ADSCs+Res组的腓肠肌恢复较模型组好,且腓肠肌肌纤维百分比显著高于模型组。脊髓的尼氏染色显示ADSCs,ADSCs+Res完整运动神经元数量增加,且ADSCs+Res组的神经元数量高于ADSCs组。综上所述:Res能够提高大鼠ADSCs抗凋亡的能力,且该作用可能是提高ADSCs临床治疗的关键。之后,我们建立了大鼠坐骨神经损伤模型,结果显示Res孵育ADSCs后神经修复效果好于未孵育的ADSCs,因此,当ADSCs作为种子细胞使用时,可以考虑Res孵育ADSCs后,可将其应用于神经损伤的修复。