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背景与目的近年来,口腔临床患者的首选修复方法是种植修复,金属材料钛由于其良好的生物性能被广泛用于制作成牙种植体。种植体植入体内后,由于长期在复杂的人体环境中,种植体表面的钛离子会释放到周围组织中。引起并加重种植体植入后种植体周围炎的原因之一可能是种植体表面释放的钛离子刺激明显的炎症反应,从而降低了骨与种植体之间的结合。目前对种植体周围炎所致的种植体不良骨结合的病理机制的研究是科研的难点之一,因此其致病机制将会对临床上延长口腔种植体的使用寿命具有巨大的意义。巨噬细胞是组织炎症微环境中的重要细胞,广泛参与到炎症的初始阶段,可能介导了钛颗粒或离子引起的种植体周围骨丢失。巨噬细胞极化参与多种生物学过程的调控,但在钛离子的环境中巨噬细胞抑制成骨细胞成骨活性的作用尚不清楚,随后我们进行了转录组测序分析,筛选出了可信度较高的基因Agt。基因Agt的编码产物为血管紧张素原(angiotensinogen,Agt),AGT是一种α-2-球蛋白,主要是由肝脏产生的,并释放到血液循环中发挥作用。AGT在骨关节炎患者中上调,并在炎症性骨病的发展中起关键的作用。然而,Agt基因的上调或下调能否影响钛离子通过巨噬细胞对成骨细胞的功能障碍及其背后的作用机制尚无人报道。综上,本研究旨在探究钛离子通过巨噬细胞对成骨细胞成骨活性的影响,明确巨噬细胞极化以及成骨细胞内的Agt基因是否参与到巨噬细胞介导的钛离子损害成骨细胞成骨活性的过程中,以揭示钛离子通过巨噬细胞在种植体无菌性松动中的作用和机制。材料与方法1.钛离子通过巨噬细胞对成骨细胞成骨能力的影响成骨细胞选用小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞,巨噬细胞选用小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞。通过CCK-8检测不同浓度钛离子对成骨细胞和巨噬细胞增殖能力的影响,观察其对两种细胞是否有细胞毒性,筛选出对细胞存活增殖无影响的钛离子浓度。建立加入钛离子的实验组与未加入钛离子的对照组,通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色观察成骨细胞的成骨能力。利用带有0.4μm PET膜小室的6孔transwell培养板将两种细胞共培养,巨噬细胞置于小室膜上,成骨细胞培养至孔板底部。在共培养模式下建立加入钛离子的实验组与未加入钛离子的对照组,观察在各组不同条件的干预下成骨细胞成骨能力的改变。主要通过ALP染色,qRT-PCR,Western Blot等方法检测成骨功能相关的基因及蛋白的表达水平,以此反映两组成骨细胞的成骨能力。2.钛离子对巨噬细胞产生极化的影响在成骨细胞与巨噬细胞共培养模式下,通过流式细胞仪对巨噬细胞表型进行鉴定,检测钛离子是否对巨噬细胞的极化有影响。通过细胞免疫荧光染色,qRT-PCR,Western Blot,ELISA检测是否有细胞炎性因子的产生。3.敲低或过表达成骨细胞Agt基因对钛离子通过巨噬细胞抑制成骨细胞成骨能力的影响在成骨细胞与巨噬细胞共培养模式下,实验设为两组,加入钛离子组的实验组与不加钛离子的对照组。分别对两组共培养体系中的成骨细胞进行收样,且每组设立3个重复组,样本全部收集完毕后,依托上海吉玛公司进行转录组测序分析,主要包括基因的质量评估、转录因子预测、数据库对比等操作。获得测序分析的基因表达水平的原始数据后,确定两组样本间上下调的差异表达基因,并通过对差异表达基因进行基因本体论(gene ontology,GO)分析,以确定差异表达基因的功能富集情况。预测成骨细胞成骨能力的降低与某个差异表达基因之间存在的潜在关系,探讨可能作用的作用机制。通过qRT-PCR对筛选出的差异表达基因进行验证,找出可靠性较高的Agt基因。通过慢病毒转染的方式使成骨细胞Agt基因敲低和过表达,并利用Western Blot检测敲低和过表达效率。确定Agt能够在成骨细胞中能够稳定敲低和过表达后,在成骨细胞与巨噬细胞共培养体系中建立正常培养基组、10 μg/mLTi离子培养基组、10 μg/mLTi+shNC组(敲低对照组)、10μg/mLTi+shAgt组(敲低实验组)、10μg/mLTi+OENC组(过表达对照组)、10 μg/mLTi+OEAgt组(过表达实验组)进行成骨细胞成骨功能上的比较。主要采用ALP染色、Western Blot检测成骨功能相关蛋白表达水平以检测成骨细胞的成骨能力,验证敲低及过表达成骨细胞Agt基因对巨噬细胞在钛离子环境中对成骨细胞造成的功能影响。结果1.10 μg/mL钛离子通过巨噬细胞对成骨细胞的成骨能力有抑制作用CCK-8检测结果显示10 μg/mL钛离子对成骨细胞和巨噬细胞的增殖均无明显的影响,ALP染色及Western Blot结果显示10 μg/mL钛离子对成骨细胞的成骨能力无明显影响。在体外成功构建成骨细胞与巨噬细胞共培养模型,ALP染色,qRT-PCR,Western Blot结果表明与对照组相比,在巨噬细胞的介导下,加入钛离子组的成骨细胞成骨活性降低,钛离子可能通过巨噬细胞对成骨细胞的成骨能力造成了影响。2.10μg/mL钛离子通过调控巨噬细胞向M1方向极化产生炎症反应成骨细胞与巨噬细胞共培养后,加入钛离子组的巨噬细胞与对照组相比,qRT-PCR,Western Blot,细胞免疫荧光染色,流式细胞术结果显示M1型巨噬细胞增多,M2型巨噬细胞减少,促炎细胞因子增多。3.敲低成骨细胞Agt基因改善10 μg/mL钛离子通过巨噬细胞介导的成骨细胞成骨活性的降低,过表达成骨细胞Agt基因则相反通过转录组测序分析,比较在成骨细胞与巨噬细胞共培养体系下,加入10μg/mL钛离子与未加入钛离子的两组成骨细胞之间基因表达水平的差异,并按照P值<0.05和绝对倍数变化≥1.2这两个基本原则对基因进行筛选,共得到63个差异基因。生物信息学分析结果提示差异基因在GO功能上主要富集在细胞外基质,生物调节,离子结合,在信号通路上主要富集在炎症,骨代谢等相关生物过程。通过慢病毒转染技术在体外实验中成功构建了成骨细胞敲低和过表达Agt基因的模型,转染效率较好。对各组成骨细胞的成骨功能进行检测时发现敲低Agt基因可改善钛离子通过巨噬细胞介导的对成骨细胞成骨功能的抑制作用,过表达Agt基因则会导致成骨细胞成骨功能的抑制作用加重。结论1.10 μg/mL钛离子通过巨噬细胞抑制了成骨细胞的成骨功能。2.巨噬细胞在10μg/mL钛离子环境中向M1型极化并产生炎症反应。3.通过敲低成骨细胞的Agt基因可以改善10 μg/mL钛离子通过巨噬细胞介导的对成骨细胞成骨功能的损害。