【摘 要】
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在神经退行性疾病中,阿尔茨海默病（AD）最为常见,他在疾病初期并没有显示出明显的特征,一旦患者出现记忆力严重下降等行为学异常,他的脑部结构便出现了不可逆的变化。β淀粉样蛋白（Aβ）是导致脑部变化的主要原因之一,被认为与阿尔茨海默病的发病过程密切相关,在近几年的研究当中,研究人员通常会将Aβ生物标志物作为诊断与治疗AD的重要靶点。本试验首先通过PCR技术从纳米荧光素酶pNL1.2载体中扩增出目的基因
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在神经退行性疾病中,阿尔茨海默病（AD）最为常见,他在疾病初期并没有显示出明显的特征,一旦患者出现记忆力严重下降等行为学异常,他的脑部结构便出现了不可逆的变化。β淀粉样蛋白（Aβ）是导致脑部变化的主要原因之一,被认为与阿尔茨海默病的发病过程密切相关,在近几年的研究当中,研究人员通常会将Aβ生物标志物作为诊断与治疗AD的重要靶点。本试验首先通过PCR技术从纳米荧光素酶pNL1.2载体中扩增出目的基因Nanoluc,并连接至含有特异性单域抗体VHH基因的载体pET-25b（+）上,进行重组质粒的构建;将构建好的重组质粒转至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,诱导表达重组蛋白并优化重组蛋白的表达条件,利用SDS-PAGE的方法分析表达的产物,使用镍柱对重组蛋白进行纯化,利用BCA法测定蛋白浓度的试剂盒对重组蛋白浓度进行测定。使用同样的流程构建不含有VHH基因的阴性对照质粒pET-25b（+）-Nanoluc。经间接法ELISA和生物发光一步法ELISA鉴定重组蛋白pET-25b（+）-VHH-Nanoluc与Aβ寡聚体的结合活性。并将表达好的重组蛋白通过脑立体定位仪注入小鼠脑内,尾静脉注射底物,通过活体成像仪检测重组蛋白与模型鼠脑内Aβ的结合情况。以下为试验研究结果:（1）成功构建重组质粒pET-25b（+）-VHH-Nanoluc及阴性对照质粒pET-25b（+）-Nanoluc,重组蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞内表达的蛋白大小分别为37k Da及22k Da,符合预期。重组蛋白pET-25b（+）-VHH-Nanoluc在乳糖作为诱导剂、诱导温度为16℃,诱导培养12 h时所表达的蛋白浓度最高,为216.85μg/m L。（2）通过间接法ELISA和生物发光一步法ELISA检测到重组蛋白与Aβ寡聚体具有较高的结合活性。通过使用脑立体定位仪向小鼠脑内注射蛋白,尾静脉注射底物,活体成像仪检测到较高的荧光值,初步证实重组蛋白pET-25b（+）-VHH-Nanoluc在体外试验中与模型鼠脑内Aβ的结合能力,阴性对照组注入重组蛋白pET-25b（+）-Nanoluc,未检测到荧光值,证实不是酶与底物发生非特异性结合。本研究制备了一类能够与Aβ寡聚体特异性结合且能与AD模型动物脑内Aβ成像的蛋白,为后续研究靶向Aβ的治疗方案及检测治疗效果提供了新思路。
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