猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种高度接触性肠道传染病。2010年以来,随着高致病性变异毒株的出现,传统的PEDV灭活疫苗及减毒疫苗对新出现的PEDV变异毒株的血清中和抗体滴度通常较低,不再能提供有效的保护作用。因此为有效防控PED,新型疫苗的研究成为了研究者普遍关注的热点领域。本试验利用生物学分析软件,结合在线数据库筛选出PEDV S2基因的B细胞表位肽基因片段,并人工合成所对应的表位肽。将此表位肽与钥孔血蓝蛋白（KLH）偶联后作为抗原,免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠,委托吉尔生化（上海）有限公司制备出表位特异的单克隆抗体,该单克隆抗体称为Mc Ab-Epitope S2。并在本实验室通过间接ELISA方法测定单克隆抗体的效价。利用DNA重组技术,制备了融合基因SLP-Epitope S2,并将其克隆到乳杆菌表达载体p TRK892中,成功构建了重组质粒p TRK-SLP-Epitope S2。随后,将经过PCR、双酶切及基因测序法鉴定正确的重组质粒p TRK-SLP-Epitope S2电转化到副干酪乳杆菌中进行表达。分别采用SDS-PAGE、Western blot、免疫荧光和Li Cl洗脱等方法鉴定其表达产物性质和免疫原性。获得了如下试验结果:1.通过生物学软件分析及在线数据库中确定出PEDV S2基因的B细胞表位肽,即为:MQYVYTPTYYML。多肽免疫后BALB/c小鼠血清中多克隆抗体的效价达到1∶2000。而杂交瘤细胞培养物上清及腹水ELISA检测结果显示Mc Ab-Epitope S2效价达到1∶4000。2.通过DNA重组技术,成功构建了PEDV S2基因B细胞表位肽乳酸菌表达载体pTRK-SLP-Epitope S2。并在副干酪乳杆菌中成功表达了融合基因SLP-Epitope S2,经SDS-PAGE、Western blot试验鉴定结果显示,约在48 k Da大小处出现目的条带,与理论值相符。与PEDV感染血清和重组S蛋白高免血清反应结果与Mc Ab-Epitope S2的结果一致,表明在副干酪乳杆菌中表达的融合基因SLP-Epitope S2具备反应原性。3.为了进一步证实融合蛋白SLP-Epitope S2在副干酪乳杆菌中的表达位置,在细菌培养物上清的Western blot试验结果显示未检测出融合基因表达产物,表明目标蛋白不会分泌表达。通过共聚焦免疫荧光检测结果显示,与对照组副干酪乳杆菌无绿色荧光信号相比,绝大多数重组副干酪乳杆菌均被激发出明显的绿色荧光信号,但是未能精确定位到细胞浆里还是细胞膜上发光。采用4 M Li Cl处理各组副干酪乳杆菌使其膜蛋白洗脱下来,经过SDS-PAGE、Western blot结果显示,重组副干酪乳杆菌在48 k Da大小处有目的条带,而对照组则无目的条带出现。初步表明融合蛋白SLP-Epitope S2表达于副干酪乳杆菌膜表面。结论:本研究成功为乳酸菌活菌载体表位肽疫苗的研究奠定了基础。