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目的:多聚谷氨酰胺(polyglutamine,poly Q)疾病是一类由遗传因素导致的神经退行性疾病,该疾病的特点是影响基因中CAG重复序列的异常扩展,导致翻译产物中谷氨酰胺重复数目异常增加而引发,目前尚有大量病理机制类似的疾病尚未被揭示。到目前为止,至少有9种已知的Poly Q疾病,包括亨廷顿病(Huntington’s disease,HD)。虽然不同的Poly Q疾病涉及不同的致病基因,但大量的研究表明其致病机制与毒性功能的获得有关,即致病性Poly Q蛋白引起选择性神经元毒性;Poly Q突变蛋白的积累和神经元核内包涵体(NIIs)的形成是致病过程的核心因素。关于可能致病机制的假设包括:(1)蛋白质错误折叠;(2)基因转录和表达失衡;(3)细胞内蛋白质稳态失败;(4)线粒体功能障碍。HD是一种常见且无法治愈的遗传性神经退行性疾病。HD为常染色体显性遗传,典型患者多为中年起病,症状可持续15-20年,临床主要表现为运动障碍、认知功能下降及精神症状。目前认为该病是由显性遗传的CAG三核苷酸在4号染色体上的HD基因中重复扩增引起的,但HD的发病机理尚未完全阐明。先前的研究表明,CAG重复次数与发病年龄有关。但是,只有50%到70%患者可归因于重复次数。此外,临床表型的显著差异还没有得到很好的解释。因此,所有这些变化表明其他致病因素可能影响疾病的发生、发展。长链非编码RNA(Lnc RNA)是一种长度大于200个核苷酸单位的RNA。由于没有开放阅读框(ORF),因此称为非编码RNA。现有研究表明,lnc RNA作为基因表达的调节剂,通过表观遗传,转录和转录后修饰,在不同的生物活性中起着至关重要的作用。Dynamin 3 opposite strand(DNM3OS)是位于染色体1上的lnc RNA,并插入Dynamin 3基因内含子的独立转录单元中。先前的研究发现DNM3OS参与了多种病理生理过程,包括免疫炎性反应,并参与多种肿瘤发生、发展。本研究初步探讨DNM3OS在HD细胞模型的表达变化,以及对HD分子发病机制的影响。方法:采用经多西环素诱导后表达绿色荧光蛋白标记的HD第一外显子片段含有23个(正常)或74个(变异)多聚谷氨酰胺片段(N-htt-Q23或-Q74)的大鼠肾上腺神经嗜铬细胞瘤PC12细胞模型,通过实时定量PCR以评估lnc RNA DNM3OS和mi R-196b-5p的表达,并进行蛋白质印迹分析以探讨甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)在HD PC12细胞中的表达水平。使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP缺口末端标记(TUNEL),Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测细胞凋亡情况,应用活性氧(ROS)测定和细胞活力分析了GAPDH抑制对HD PC12细胞的影响。我们同时应用免疫荧光观察DNM3OS、mi R-196b-5p及GAPDH表达水平改变对细胞内包涵体形成的影响。此外,采用双荧光素酶报告基因检测法来鉴定DNM3OS,mi R-196b-5p和GAPDH之间的直接调控关系。结果:1、DNM3OS在HD大鼠肾上腺神经嗜铬细胞瘤PC12(N-htt-Q74)细胞中高表达;mi R-196b-5p在N-htt-Q74细胞中低表达,与DNM3OS表达水平呈负相关。抑制N-htt-Q74细胞内DNM3OS表达水平能够抑制细胞细胞凋亡,并能够抑制细胞包涵体形成。2、沉默DNM3OS可以抑制N-htt-Q74细胞凋亡,增加N-htt-Q74细胞活力及促进细胞存活。mi R-196b-5p受DNM3OS的直接调控,两者之间存在特异性的调控关系。3、过表达mi R-196b-5p抑制N-htt-Q74细胞凋亡,增加细胞活力并促进N-htt-Q74细胞存活,抑制N-htt-Q74细胞内包涵体形成;沉默mi R-196b-5p促进N-htt-Q74细胞凋亡,降低N-htt-Q74细胞活力。4、GAPDH在N-htt-Q74细胞中高表达,并与mi R-196b-5p表达呈负相关。GAPDH促进N-htt-Q74细胞包涵体形成,过表达GAPDH降低N-htt-Q74细胞活力。5、GAPDH的3’UTR区存在mi R-196b-5p的特异性结合位点。DNM3OS通过调节mi R-196b-5p的表达水平进而调控GAPDH的表达。结论:1、DNM3OS在N-htt-Q74细胞中高表达,沉默DNM3OS抑制N-htt-Q74细胞凋亡,促进N-htt-Q74细胞存活及抑制细胞内包涵体形成。2、mi R-196b-5p在N-htt-Q74细胞中低表达,过表达mi R-196b-5p能够抑制N-htt-Q74细胞凋亡,增加细胞活力并促进细胞存活,抑制包涵体形成。3、GAPDH在N-htt-Q74细胞中高表达。GAPDH受mi R-196b-5p调控,并参与N-htt-Q74细胞包涵体形成。4、沉默DNM3OS通过促进mi R-196b-5p的表达,加强其对DNM3OS的负性调控作用,降低GAPDH表达,抑制N-htt-Q74细胞凋亡,增加细胞活力,抑制细胞内包涵体形成,促进细胞存活。