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目的:课题组前期研究发现Ⅵ型分泌系统相关FHA结构域蛋白Tag H敲除可导致霍乱弧菌溶血活性显著增强,本课题拟进一步对Tag H蛋白调控霍乱弧菌Hly A溶血活性和细胞毒性的分子机制进行研究,为丰富Hly A的分子调控机制及深入了解Tag H蛋白的生物学功能提供实验依据。方法:原核表达和纯化Hly A蛋白并制备多克隆抗血清,用于分析待测菌株中Hly A水平变化。在前期基因敲除基础上,进一步构建Δtag H::tag H回复菌株,明确tag H基因对霍乱弧菌溶血活性和细胞毒性的影响。构建Δtag HΔhly A双敲株探究Tag H是否通过调控Hly A表达而介导的溶血和细胞毒作用等病理损伤变化。构建T6SS突变株Δtss B和Δtss M,探究Tag H对Hly A表达的影响是否是T6SS受损的下游效应。通过荧光定量PCR分析tag H基因敲除前后hly A转录调控因子的表达情况,并用荧光素酶报告实验分析启动子活性,进一步构建Δtag H+p BAD24-fur过表达菌株和Δtag HΔhly U双敲除菌株,以探究Tag H在转录水平调控hly A转录的可能分子机制。通过构建Δtag HΔprt V双敲株及回复株,并进行相关表型验证分析,探究Tag H蛋白是否在翻译后水平通过Prt V蛋白酶调控Hly A降解效应。通过对预测的Tag H与磷酸肽结合相关的保守残基丝氨酸和赖氨酸位点进行点突变,分析点突变菌株的溶血活性和Hly A蛋白的表达量,以验证这些保守的磷酸肽结合残基是否也与霍乱弧菌中Tag H对溶血活性的调节有关。结果:成功表达并纯化Hly A蛋白,免疫小鼠后可获得较高效价的多克隆抗血清。成功构建了Δtag H::tag H回复菌株和Δtag HΔhly A双敲菌,行溶血实验和细胞毒性实验结果显示Δtag H菌株溶血活性和细胞毒性较野生菌株显著增强,而且Δtag H::tag H回复株溶血活性和细胞毒性与野生菌株相似,提示Tag H负向影响霍乱弧菌溶血活性和细胞毒性。Δtag HΔhly A培养上清液的溶血活性和细胞毒性几乎完全丧失;Western blot结果显示Δtag H突变株上清液和全菌裂解物中的Hly A的表达量显著高于野生株,Δtag H::tag H回复株中的Hly A的表达量与野生株相似,以上结果提示Tag H调控霍乱弧菌的溶血活性和细胞毒性主要依赖于Hly A的表达。成功构建了T6SS突变株Δtss B和Δtss M,行血平板溶血环测定和Western blot实验结果显示tss B和tss M敲除均导致Hcp分泌抑制,但对溶血活性和Hly A表达没有影响,提示Tag H对溶血活性的调控不依赖于T6SS的完整性。荧光定量和启动子荧光素酶报告实验结果显示,与野生型相比,Δtag H突变体中hly A和hly U的转录水平和启动子活性显著上调,fur转录水平和启动子活性显著下调,而Δtag H::tag H回复株中hly A、hly U和fur的转录水平和启动子活性恢复到接近野生型的水平。成功构建Δtag H+p BAD24-fur过表达菌株和Δtag HΔhly U双敲除菌株,并行荧光定量和试管溶血实验结果显示Δtag HΔhly U的溶血活性和hly A转录显著低于Δtag H突变体和野生株,而Δtag H+p BAD24-fur的溶血活性和hly A转录与Δtag H菌株相比部分恢复,以上结果提示Tag H在转录水平调控hly A的转录且依赖于Hly U和Fur协同调节。荧光定量PCR结果显示Δtag H负向调控Prt V蛋白酶表达,进一步成功构建Δtag HΔprt V双敲菌和Δtag HΔprt V::prt V回复菌,并行溶血实验和细胞毒性实验,结果显示Δtag HΔprt V突变株上清液的溶血活性略高于Δtag H突变株,Δtag HΔprt V::prt V回复株的溶血活性和细胞毒性均显著低于Δtag H和Δtag HΔprt V菌株;Western blot实验结果显示Hly A在Δtag H和Δtag HΔprt V菌株的上清液中以相似的水平表达,在Δtag HΔprt V::prt V菌株中,Hly A的表达显著降低,以上结果提示Tag H在翻译后水平调控Hly A的降解可能依赖于Prt V蛋白酶的表达。成功构建Tag HS38A、Tag HK54A和Tag HS38AK54A点突变株并行溶血实验,结果显示与Δtag H::tag H回复菌株的溶血活性相比,Δtag H::tag HS38A、Δtag H::tag HK54A和Δtag H::tag HS38AK54A突变株的溶血活性依次增加;Western blot实验结果也显示Δtag H::tag HS38A、Δtag H::tag HK54A和Δtag H::tag HS38AK54A菌株上清液中Hly A的分泌量依次升高,以上结果提示Tag H的磷酸肽结合位点在溶血素Hly A表达调控中发挥关键作用。结论:本研究首次发现FHA结构域蛋白Tag H除了调控T6SS外,还在控制霍乱弧菌的溶血活性中发挥重要作用。Tag H在转录和翻译后水平负调控Hly A的表达,Tag H的FHA结构域的磷酸肽结合位点在调节溶血活性中起关键作用。这项研究为揭示Tag H在Hly A和T6SS中的调节作用和Hly A在霍乱弧菌的致病机制中起关键作用提供了证据,加深了对Tag H和Hly A功能的认识,并为后续Hly A的相关研究奠定坚实的前期基础。