论文部分内容阅读
基太克湖流域是南极菲尔德斯半岛内陆典型的冰雪融溪成湖微环境。该流域地处丘陵之间,远离海岸,动物稀少,几乎无人类活动,溪流两侧有零星苔藓分布,夏季上游山体冰雪融化成溪流汇聚基太克湖。本研究以从基太克湖流域上、中、下游采集的4份土壤样品为对象,采用可培养法、高通量测序法、宏基因组测序法三种技术途径,对样品中硝化菌、反硝化菌、固氮菌、氨化菌的多样性特征、功能活性、产酶菌株、以及氮循环主代谢途径等状况进行了较为系统的研究和分析。研究结果如下:1、可培养氮循环细菌研究结果表明:基太克湖流域土壤中氮循环细菌的数量为氨化菌>硝化菌>反硝化菌>固氮菌,它们总体在1.1×105~2.5×108 MPN/g或CFU/g,彼此之间相差大约1个数量级;菌体形态以杆状、短杆状为主,少数为球状(但氨化菌以球状为主);菌落形态大小不一,主要呈白色、乳白色、黄色、深黄色等。总体上看氨化菌和硝化菌的形态多样性要高于反硝化菌和固氮菌。另外,发现有4株分离菌具有极强氨化功能,3株菌具有较强硝化功能,4株菌具有极强反硝化功能活性。另发现一批产酶活性较强的菌株,包括6株产过氧化氢酶,2株产氧化酶,1株产DNA酶,2株产酪蛋白酶,3株产七叶苷酶,1株产吐温60分解酶,2株产藻胶酶。16S系统发育鉴定表明,采集土壤中的氨化菌分布于3纲(Gammaproteobacteria、Actinomycetia、Alphaproteobacteria)、4属(Psychrobacter、Pseudomonas、Pseudarthrobacter、Caulobacter),固氮菌分布于3纲(Gammaproteobacteria、Bacilli、Actinomycetia)、4属(Pseudomonas、Bacillus、Pseudarthrobacter、Rhodococcus),硝化菌分布于2纲(Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria)、3属(Pseudomonas、Pantoea、Agrobacterium),反硝化菌分布于2纲(Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria)、3属(Pseudomonas、Acinetobacter、Agrobacterium);这4类氮循环细菌的优势菌群均为Gammaproteobacteria纲的Pseudomonas属。另外,分离菌与模式菌的16S r DNA序列相似度在99.05-100%,没有发现潜在的新物种出现。2、氮循环细菌功能基因(nxr A、nir S、nif H、amo A)的高通量测序分析表明:基太克湖流域土壤中硝化菌有5纲、6属,优势菌群为unclassifieddBacteria;反硝化菌有7纲、14属,优势菌群为Gammaproteobacteria纲的Rhodanobacter属和unclassifiedknorankdBacteria菌群;固氮菌有6纲、8属,优势菌群为unclassifiedknorankdBacteria菌群;氨氧化菌有3纲、3属,优势菌群为Betaproteobacteria纲的Nitrosospira属。总体上看,在基太克湖流域土壤氮循环细菌中,反硝化菌、固氮菌的多样性要比硝化菌、氨氧化菌相对高一些,且它们都存在许多未培养及未分类菌群。从菌群在样品间的组成分布来看,样品JCB-3的硝化菌组成比较特殊,而样品JCB-2与JCB-4接近。样品JCB-1与JCB-2的反硝化菌组成接近,而样品JCB-3与JCB-4接近。样品JCB-2、JCB-3的固氮菌组成接近,而JCB-4与其他3个样品的相似性均很小。样品JCB-1与JCB-2的氨氧化菌组成接近,而JCB-3与其他3个样品的相似性均很低。此结果表明,基太克湖流域中游JCB-3样品中的硝化菌和氨氧化菌组成相较其它3个样品来说比较特殊。土壤理化因子对菌群组成的影响分析表明,基太克湖流域土壤中性偏酸,含水率较高,有机C和有机N含量均很低,其它营养盐含量也很低,属于营养极度贫乏土壤。相对来说,有机C对样品硝化菌、反硝化菌、固氮菌组成影响较大,对氨氧化菌的影响较小;有机N对样品固氮菌组成影响较大,而对硝化菌、反硝化菌、氨氧化菌的组成影响较小;NO2--N、NO3--N、NH4+-N对样品硝化菌、反硝化菌、氨氧化菌的组成影响均较大,而对固氮细菌的组成影响较小;Si对硝化菌和氨氧化菌的组成影响较大,而对反硝化菌和固氮菌的组成影响较小。另外,PO43--P和p H对4种氮循环细菌的组成均有较大影响。3、样品宏基因组测序分析结果表明:基太克湖流域4份土壤样品共注释出6条氮循环代谢途径,包括硝化作用、反硝化作用、固氮作用、厌氧氨氧化、异化性硝酸盐还原、同化性硝酸盐还原等代谢途径。其中,参与硝化途径的酶及基因分别是:氨单加氧酶(Amo CAB),羟胺脱氢酶(Hao),亚硝酸盐氧化还原酶(Nxr AB)。参与反硝化途径的酶和基因分别是:硝酸盐还原酶(Nar GHI、Nap AB),亚硝酸盐还原酶(Nir KS),一氧化氮还原酶(Nor BC),氧化亚氮还原酶(Nos Z)。参与固氮途径的酶和基因主要是固氮酶(Nif DKH)。参与氨氧化途径的酶与基因分别是氨单加氧酶(Amo CAB)和羟胺脱氢酶(Hao);但由缺乏对Hzs、Hdh的基因注释,推测其中的厌氧氨氧化途径可能不存在。参与异化性硝酸盐还原途径的酶分别是:硝酸盐还原酶(Nar GHI、Nap AB),亚硝酸盐还原酶(Nir BD、Nrf AH)。另外,还发现与胞外硝酸盐转运有关的MFS蛋白、底物结合蛋白、通透酶蛋白、ATP结合蛋白等有关的NRT、Nrt ABCD基因,以及与原核生物的碳固定、氨基酸合成、甲烷代谢、乙醛酸代谢等相关的代谢途径。从样品中与氮代谢有关的基因数目推测,样品JCB-4可能有比较强的氮代谢活跃度,而样品JCB-3的活跃度最低,这也许与样品所处地理微环境有关。样品之间氮代谢途径相似性分析表明:样品JCB-2和JCB-4具有相似的氮代谢途径,样品JCB-1与之也有相似之处,而样品JCB-3的与其它3个样品的相似性很小,推测可能是此处的微环境土壤营养物相对更少所致。另外,土壤理化因子对氮循环代谢途径的影响分析表明,有机N的影响程度最小,而有机C、p H、NO2--N、NO3--N、NH4+-N、Si、PO43--P的影响均相对较大。总之,本论文对南极菲尔德斯半岛基太克湖流域微环境土壤中的硝化菌、反硝化菌、固氮菌、氨化菌的多样性、功能活性、产酶菌株、以及相关氮代谢途径状况进行了较为全面系统的研究和分析。其结果既补充了先前对菲尔德斯半岛氮循环微生物研究的不足,同时也为南北极地、大陆雪山高原等类似生态地理环境的氮循环微生物研究提供了有价值的参考。