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研究背景和目的：
人口老龄化是当今世界一个普遍性的现象和趋势。中老年男性睾酮不足及其引发的性腺机能减退(late-onsethypogonadism，LOH)问题正吸引着广泛的公众关注。LOH是睾酮不足引起的一种综合征，随着年龄增大，发生率逐渐增多，症状有明显的特征性、可导致多个器官出现功能异常，使患者生活质量降低。欧洲男性衰老研究(TheEuropeanMale AgeingStudy,EMAS)最近定义了严格的LOH诊断标准[包括血清总睾酮(TT)、游离睾酮(FT)的水平和三个性症状：勃起功能障碍、性冲动频率减少和晨间勃起频率的降低]，已被广泛接受和应用。睾酮替代治疗被广泛采用，但其真正的受益以及短期和长期的风险，还缺乏可用的循证医学依据，因此，预防LOH就显得尤为重要。大多数研究主要研究了血清激素(TT和FT)的影响因素(如生活方式因素和慢性疾病等),但LOH影响因素方面的研究较少。虽然有报道，代谢综合征和糖尿病是LOH的危险因素，但他们使用了不同的LOH标准。因此，我们将研究新标准下LOH及TT和FT的影响因素，为LOH的防治提供一定的理论依据。人体睾酮水平受到年龄、腰围、血压、血糖和健康状况等多种自身内部因素影响，人们可通过减少腰围、控制血压和血糖、以及优化老年男性的健康状况来减缓睾酮下降、预防LOH；然而，睾酮水平还时刻受到外源性的环境雌激素(Environmentalestrogen， EEs)的影响。双酚A(BisphenolA，BPA)是一种公认的EEs，具有雌激素样活性。发育期的胎儿和新生儿具有较低的代谢清除率和有限的血清结合蛋白，致使BPA更容易积累、暴露风险更高。孕期接触BPA可能会降低雄性幼崽的睾酮水平并引起睾丸细胞的凋亡，然而，其作用机制尚不清楚。因此,我们采用人群流行病学调查的方式研究EMAS标准下LOH及睾酮的影响因素；并且我们构建了小鼠孕期BPA暴露模型，探讨BPA暴露对子代小鼠睾丸功能的影响及其机制。
方法：
首先，我们采用人群流行病学调查的方式，招募317例男性志愿者(年龄在36-80岁)完成健康检查和两个调查问卷(健康和生活方式问卷和性功能调查问卷)。数据参数如收缩压(SBP)、葡萄糖、白蛋白等在医疗记录获得；采用化学发光免疫分析法测定TT和性激素结合球蛋白(SHBG),FT、Bio-T通过公式计算获得。然后，我们设计建立了小鼠孕期BPA暴露的动物模型，采用8周龄雌性C57/BL6J小鼠，随机分为三组：溶剂对照组(含1%乙醇)、低浓度BPA组(1mg/kg/day)和高浓度BPA组(10mg/kg/day)。成对交配。次日发现阴道栓确认怀孕，该日记为怀孕第一天(GD1)，怀孕期间通过饮水染毒，溶剂对照组母鼠饮用含有1%乙醇的饮用水(含1%乙醇溶液，作为溶剂对照)，低浓度BPA组母鼠饮用含5μg/mLBPA的饮用水，高浓度BPA组母鼠饮用含50μg/mLBPA的饮用水。孕鼠自GD1开始通过饮水染毒BPA，至分娩当天停止。雄性幼鼠于产后(PND)1、14和35天取材。取材时计数每窝幼鼠数量、体重、性别，心脏穿刺收集血液并分离出血清，用于血清睾酮检测。左侧睾丸用于组织学检测；右侧睾丸用于基因检测。应用化学发光免疫法检测血清睾酮水平；采用免疫组化和实时荧光定量PCR检测类固醇生成关键酶(类固醇生成急性调节蛋白(StAR)，胆固醇侧链裂解酶(CYP11A1)和3β-羟甾脱氢酶/△5-4异构酶(3β-HSD)和细胞凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、FasL、Caspase-3)的蛋白定位和mRNA表达；通过TUNEL染色评估睾丸内细胞的凋亡。
结果：
1.人群流行病学调查显示：
1).根据EMAS诊断标准，本组研究资料显示LOH患病率是12.64%。
2).LOH阳性志愿者的年龄、腰围、收缩压和血糖明显高于LOH阴性志愿者，而TT和FT明显低于LOH阴性志愿者。
3).Logistic回归分析显示，年龄、腰围、血糖、收缩压(SBP)和健康状况是LOH的影响因素。
4).相关分析结果显示腰围、收缩压和血糖与TT明显相关，是TT的影响因素，而年龄、收缩压和健康状态与FT明显相关，是FT的影响因素。TT随年龄的增加未发生显著性变化，FT随年龄的增长而明显下降。
2.动物暴露实验显示：
1).小鼠孕期经饮水暴露于5and50g/mlBPA后，与对照组相比，两组均可显著降低PND14子代小鼠的体重，但对PND35子代小鼠的体重影响不明显。
2).两BPA浓度组暴露后均可显著降低PND14雄性子代小鼠的血清睾酮水平，但仅50g/mlBPA浓度组降低PND35雄性子代小鼠的血清睾酮水平。
3).与对照组相比，两BPA暴露组均可下调PND1和PND14睾酮生成关键酶(StAR,CYP11A1和3β-HSD)的mRNA表达，且高浓度BPA能下调PND35睾酮生成关键酶(StAR,CYP11A1和3β-HSD)的mRNA表达，表明BPA孕期暴露后血清睾酮浓度减少可能是间质细胞睾酮生成能力降低的结果。
4).睾丸细胞凋亡主要位于生精小管内，睾丸间质未见明显细胞凋亡。与对照组相比，两BPA暴露组均可明显增加TUNEL-阳性生精小管的比例，而只有高浓度BPA暴露组均可明显增加PND35TUNEL-阳性生精小管的比例，
5).两BPA浓度组均可下调PND1和PND14抗凋亡基因Bcl-2基因的表达，而且，高浓度BPA组可上调促凋亡基因Bax和Caspase-3表达，但各组中FasL的mRNA表达不明显。
结论：
随着人口老龄化和老年人口的越多，睾酮不足和性腺机能减退(LOH)问题愈加受到关注，本课题通过人群流行病学调查和动物实验研究显示：
1).根据EMAS诊断标准，汕头地区LOH患病率是12.64%。腰围、收缩压和血糖是TT的影响因素；年龄、收缩压、健康状况是FT的影响因素。年龄、腰围、血糖、收缩压和健康状况是LOH的影响因素。
2).孕期暴露于环境雌激素双酚A会造成子代睾丸功能受损，引起睾酮生成减少、睾丸内细胞凋亡增加，且主要影响PND14的睾丸功能。
3).BPA孕期暴露可能通过下调睾酮生成关键酶(StAR,CYP11A1和3β-HSD)的mRNA表达，降低睾丸间质细胞睾酮生成，进而引起血清睾酮水平降低。BPA下调抑凋亡基因bcl-2的mRNA表达和上调促凋亡基因Bax、Caspase3的mRNA表达，并可能主要通过bcl-2家族介导的线粒体凋亡通路(内源性凋亡通路)而引起睾丸细胞凋亡增加。
总之，睾酮及性腺机能减退受多种因素影响，减少腰围、控制血压和血糖、优化健康状况以及减少环境雌激素暴露可能对减缓睾酮不足、预防性腺机能减退有着重要的意义。
人口老龄化是当今世界一个普遍性的现象和趋势。中老年男性睾酮不足及其引发的性腺机能减退(late-onsethypogonadism，LOH)问题正吸引着广泛的公众关注。LOH是睾酮不足引起的一种综合征，随着年龄增大，发生率逐渐增多，症状有明显的特征性、可导致多个器官出现功能异常，使患者生活质量降低。欧洲男性衰老研究(TheEuropeanMale AgeingStudy,EMAS)最近定义了严格的LOH诊断标准[包括血清总睾酮(TT)、游离睾酮(FT)的水平和三个性症状：勃起功能障碍、性冲动频率减少和晨间勃起频率的降低]，已被广泛接受和应用。睾酮替代治疗被广泛采用，但其真正的受益以及短期和长期的风险，还缺乏可用的循证医学依据，因此，预防LOH就显得尤为重要。大多数研究主要研究了血清激素(TT和FT)的影响因素(如生活方式因素和慢性疾病等),但LOH影响因素方面的研究较少。虽然有报道，代谢综合征和糖尿病是LOH的危险因素，但他们使用了不同的LOH标准。因此，我们将研究新标准下LOH及TT和FT的影响因素，为LOH的防治提供一定的理论依据。人体睾酮水平受到年龄、腰围、血压、血糖和健康状况等多种自身内部因素影响，人们可通过减少腰围、控制血压和血糖、以及优化老年男性的健康状况来减缓睾酮下降、预防LOH；然而，睾酮水平还时刻受到外源性的环境雌激素(Environmentalestrogen， EEs)的影响。双酚A(BisphenolA，BPA)是一种公认的EEs，具有雌激素样活性。发育期的胎儿和新生儿具有较低的代谢清除率和有限的血清结合蛋白，致使BPA更容易积累、暴露风险更高。孕期接触BPA可能会降低雄性幼崽的睾酮水平并引起睾丸细胞的凋亡，然而，其作用机制尚不清楚。因此,我们采用人群流行病学调查的方式研究EMAS标准下LOH及睾酮的影响因素；并且我们构建了小鼠孕期BPA暴露模型，探讨BPA暴露对子代小鼠睾丸功能的影响及其机制。
方法：
首先，我们采用人群流行病学调查的方式，招募317例男性志愿者(年龄在36-80岁)完成健康检查和两个调查问卷(健康和生活方式问卷和性功能调查问卷)。数据参数如收缩压(SBP)、葡萄糖、白蛋白等在医疗记录获得；采用化学发光免疫分析法测定TT和性激素结合球蛋白(SHBG),FT、Bio-T通过公式计算获得。然后，我们设计建立了小鼠孕期BPA暴露的动物模型，采用8周龄雌性C57/BL6J小鼠，随机分为三组：溶剂对照组(含1%乙醇)、低浓度BPA组(1mg/kg/day)和高浓度BPA组(10mg/kg/day)。成对交配。次日发现阴道栓确认怀孕，该日记为怀孕第一天(GD1)，怀孕期间通过饮水染毒，溶剂对照组母鼠饮用含有1%乙醇的饮用水(含1%乙醇溶液，作为溶剂对照)，低浓度BPA组母鼠饮用含5μg/mLBPA的饮用水，高浓度BPA组母鼠饮用含50μg/mLBPA的饮用水。孕鼠自GD1开始通过饮水染毒BPA，至分娩当天停止。雄性幼鼠于产后(PND)1、14和35天取材。取材时计数每窝幼鼠数量、体重、性别，心脏穿刺收集血液并分离出血清，用于血清睾酮检测。左侧睾丸用于组织学检测；右侧睾丸用于基因检测。应用化学发光免疫法检测血清睾酮水平；采用免疫组化和实时荧光定量PCR检测类固醇生成关键酶(类固醇生成急性调节蛋白(StAR)，胆固醇侧链裂解酶(CYP11A1)和3β-羟甾脱氢酶/△5-4异构酶(3β-HSD)和细胞凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、FasL、Caspase-3)的蛋白定位和mRNA表达；通过TUNEL染色评估睾丸内细胞的凋亡。
结果：
1.人群流行病学调查显示：
1).根据EMAS诊断标准，本组研究资料显示LOH患病率是12.64%。
2).LOH阳性志愿者的年龄、腰围、收缩压和血糖明显高于LOH阴性志愿者，而TT和FT明显低于LOH阴性志愿者。
3).Logistic回归分析显示，年龄、腰围、血糖、收缩压(SBP)和健康状况是LOH的影响因素。
4).相关分析结果显示腰围、收缩压和血糖与TT明显相关，是TT的影响因素，而年龄、收缩压和健康状态与FT明显相关，是FT的影响因素。TT随年龄的增加未发生显著性变化，FT随年龄的增长而明显下降。
2.动物暴露实验显示：
1).小鼠孕期经饮水暴露于5and50g/mlBPA后，与对照组相比，两组均可显著降低PND14子代小鼠的体重，但对PND35子代小鼠的体重影响不明显。
2).两BPA浓度组暴露后均可显著降低PND14雄性子代小鼠的血清睾酮水平，但仅50g/mlBPA浓度组降低PND35雄性子代小鼠的血清睾酮水平。
3).与对照组相比，两BPA暴露组均可下调PND1和PND14睾酮生成关键酶(StAR,CYP11A1和3β-HSD)的mRNA表达，且高浓度BPA能下调PND35睾酮生成关键酶(StAR,CYP11A1和3β-HSD)的mRNA表达，表明BPA孕期暴露后血清睾酮浓度减少可能是间质细胞睾酮生成能力降低的结果。
4).睾丸细胞凋亡主要位于生精小管内，睾丸间质未见明显细胞凋亡。与对照组相比，两BPA暴露组均可明显增加TUNEL-阳性生精小管的比例，而只有高浓度BPA暴露组均可明显增加PND35TUNEL-阳性生精小管的比例，
5).两BPA浓度组均可下调PND1和PND14抗凋亡基因Bcl-2基因的表达，而且，高浓度BPA组可上调促凋亡基因Bax和Caspase-3表达，但各组中FasL的mRNA表达不明显。
结论：
随着人口老龄化和老年人口的越多，睾酮不足和性腺机能减退(LOH)问题愈加受到关注，本课题通过人群流行病学调查和动物实验研究显示：
1).根据EMAS诊断标准，汕头地区LOH患病率是12.64%。腰围、收缩压和血糖是TT的影响因素；年龄、收缩压、健康状况是FT的影响因素。年龄、腰围、血糖、收缩压和健康状况是LOH的影响因素。
2).孕期暴露于环境雌激素双酚A会造成子代睾丸功能受损，引起睾酮生成减少、睾丸内细胞凋亡增加，且主要影响PND14的睾丸功能。
3).BPA孕期暴露可能通过下调睾酮生成关键酶(StAR,CYP11A1和3β-HSD)的mRNA表达，降低睾丸间质细胞睾酮生成，进而引起血清睾酮水平降低。BPA下调抑凋亡基因bcl-2的mRNA表达和上调促凋亡基因Bax、Caspase3的mRNA表达，并可能主要通过bcl-2家族介导的线粒体凋亡通路(内源性凋亡通路)而引起睾丸细胞凋亡增加。
总之，睾酮及性腺机能减退受多种因素影响，减少腰围、控制血压和血糖、优化健康状况以及减少环境雌激素暴露可能对减缓睾酮不足、预防性腺机能减退有着重要的意义。