【摘 要】
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目的:正常情况下SMP30有七种剪接变异体,但七种变异体在肝细胞癌中表达水平有否区别值得探讨。通过检测肝癌细胞株、肝癌及相应癌旁组织中SMP30剪接变异体转录情况,对比七种剪接变异体的转录水平差异,了解SMP30在转录水平的选择性剪接作用,有助于探讨SMP30基因在肝癌的发生发展中的作用。方法:（1）分析已经报道的SMP30七种剪接变异体的碱基序列差异,并设计针对每一种剪接变异体的鉴定引物。（2）
【基金项目】
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国家自然科学基金（81460432）,SMP30表观遗传学对肝癌细胞生物学特性影响机制研究； 国家自然科学基金（81160362）,血清抗瘤抗体检测对肝癌早期发现和广西HCC高危人群预警作用的研究； 广西自然科学基金（2015GXNSFDA139017）,SMP30差异表达和翻译后修饰与肝癌血清中自身抗体关系研究；
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目的:正常情况下SMP30有七种剪接变异体,但七种变异体在肝细胞癌中表达水平有否区别值得探讨。通过检测肝癌细胞株、肝癌及相应癌旁组织中SMP30剪接变异体转录情况,对比七种剪接变异体的转录水平差异,了解SMP30在转录水平的选择性剪接作用,有助于探讨SMP30基因在肝癌的发生发展中的作用。方法:（1）分析已经报道的SMP30七种剪接变异体的碱基序列差异,并设计针对每一种剪接变异体的鉴定引物。（2）通过RT-PCR的实验方法将GS-Hep G2、Hu H-7、Hep3B2.1-7、SK-hep1、SK-hep1-SMP30五种肝癌细胞株及临床上收集的21例手术切除的HCC患者肝组织的RNA逆转录成c DNA。（3）通过实时荧光定量PCR检测c DNA中SMP30基因的整体转录水平,并用PCR检测SMP30七种剪接变异体的表达情况,用image J图像处理软件测量条带亮度,结合HCC患者的性别、年龄、AFP值、乙肝两对半、乙肝病毒DNA拷贝数、ALT、AST、肝硬化、肿瘤大小、肝细胞癌分级等临床指标,分析SMP30在肝癌的发生发展中的作用。（4）构建SMP30三个蛋白亚型的真核表达载体,为后续分别在肝癌细胞株中过表达SMP30的三个蛋白亚型,研究SMP30三种不同蛋白亚型的功能奠定基础。结果:（1）GS-Hep G2和Hu H-7细胞系中均存在SMP30七种剪接变异体,Hep3B2.1-7存在6种剪接变异体,未检测到Vx2的存在,在GS-Hep G2、Hu H-7、Hep3B2.1-7三种细胞中,V1、Vx1的表达量均占主导地位,用image J图像处理软件测量条带亮度,V1、Vx1两种剪接变异体之和分别占了GS-Hep G2、Hu H-7、Hep3B2.1-7细胞株中总的SMP30表达量的57.5%、63.5%、81.4%。SK-hep1细胞株低表达SMP30;在SK-hep1细胞株中过表达SMP30全长900bp的CDS后,不但检测到了全长900bp的CDS片段,同时检测到了684bp的低片段的CDS,即:在SK-hep1细胞株中过表达了SMP30的剪接变异体V1和V2后,V1和V2通过剪接过程产生了V4和Vx1,说明在细胞中过表达外源性的基因后,外源基因会参与到细胞内的剪接过程,并且在无UTR存在的情况下发生了剪接,提示剪接过程存在负反馈调控。（2）22对肝癌样本中,实时荧光定量PCR显示癌组织中的SMP30表达量低于对应的癌旁组织的SMP30的表达量,平均下调了4.16±3.20个Ct值（P＜0.05）。PCR结果显示:相对于癌旁组织,癌组织中V2（P＜0.05）、V3（P＜0.05）、V4（P＜0.05）、Vx1（P＜0.05）、Vx2（P＜0.05）、Vx3（P＜0.05）六种剪接变异体的下调具有统计学意义,癌旁正常组织和癌组织中SMP30剪接变异体V1的相对表达量差异没有显著性（P＞0.05）。统计学分析结果显示,V1在乙肝e抗体阳性的病人中下降得比阴性的病人多（P＜0.05）,Vx3在乙肝e抗原阴性的肝细胞癌病人中下降得比阳性的多（P＜0.05）,V1、V2、V3、V4、Vx1、Vx2、Vx3在癌组织中的下调量及总的SMP30的下调量与HCC患者的性别、年龄、AFP值、乙肝病毒DNA拷贝数、ALT、AST、肝硬化等指标无关（P＞0.05）。（3）在一例B淋巴瘤肝组织转移的样本中,V2、V3、V4、Vx1、Vx2、Vx3不表达,这提示SMP30的剪接变异体V2、V3、V4、Vx1、Vx2、Vx3可能与转移有比较密切的关系。结论:（1）设计出可以用于鉴定SMP30七种剪接变异体的引物。（2）可变剪接过程可能存在负反馈调控。（3）肝癌组织中SMP30转录水平的下调是因为SMP30的V2、V3、V4、Vx1、Vx2、Vx3六种剪接变异体的下调导致的,剪接变异体V1的转录水平相对稳定。（4）SMP30的剪接变异体V1和Vx3可能是一个潜在的乙肝病毒e抗原抗体标记物。（5）构建出SMP30三种蛋白亚型的过表达载体,为后续研究SMP30三种蛋白亚型的功能奠定了基础。
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