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目的:(1)利用HepG2.2.15细胞培养体系，以乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）和乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）为指标对样品库进行体外抗乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）活性筛选；(2)对筛选出有活性的样品研究其作用机制：检测样品对HBV DNA拷贝数，对HBV DNA聚合酶和HepG2.2.15细胞接种裸鼠HBsAg、HBeAg水平的影响；(3)构建一种检测HBX（hepatitis B x antigen，HBxAg）蛋白的质粒，研究抗HBV药物的作用机制和作用特点。
方法:选用阿德福韦为阳性药，用 MTT法检测样品对HepG2.2.15细胞的毒性，ELISA法检测细胞上清中HBsAg、HBeAg的变化，以细胞的半数毒性浓度(median toxic concentration,TC50)、半数抗原分泌抑制浓度(median infective concentration,IC50)、治疗指数（therapeutic index,TI）为指标，对162个样品进行初筛，筛选出有抗HBV活性样品，并进一步复筛确认。选择两个代表性的黄酮类化合物No.322、No.223进行初步构效关系研究。选用拉米夫定为阳性药用，实时荧光定量PCR法（Taqman探针法）观察其对HepG2.2.15细胞中HBV DNA拷贝数的影响。同位素法检测No.322对HBV DNA聚合酶的影响；用HepG2.2.15细胞接种裸鼠，观察样品对裸鼠血清HBsAg、HBeAg水平的影响。
构建检测 HBX蛋白的质粒：PCR扩增选择性激活序列—— HBV EnhancerⅠ，插入到分泌型碱性磷酸酶（secreted alkaline phosphatase,SEAP）报告基因表达载体上游，构建重组载体。与HBX蛋白共同转染哺乳动物细胞，建立利用微孔板检测抑制HBX蛋白活性化合物的细胞模型。
结果:
(1)对162个样品进行初筛和复筛，共筛选出21个样品TI在1～2之间，19个样品TI在2～10之间，2个化合物TI≥10。
(2)黄酮类化合物No.322 TC50>200μg/ml，对HBsAg和HBeAg分泌治疗指数分别是5.5±0.7和<1.0。No.223的TC50>200μg/ml，对HBsAg和HBeAg分泌治疗指数分别是4.3±0.7和<1.0。
(3)黄酮类化合物No.322、No.223在无毒浓度50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml时,观察其对HepG2.2.15细胞产生HBV DNA拷贝数的影响。当No.322在50μg/ml、25μg/ml两个浓度时HBV DNA拷贝数分别为0.7±0.6×105copy/ml，1.7±0.2×105copy/ml。当No.223在50μg/ml、25μg/ml两个浓度时HBV DNA拷贝数分别为3.9±0.6×105copy/ml，6.2±0.7×105copy/ml。
(4)黄酮类化合物No.322在30μg/ml、3μg/ml、0.3μg/ml浓度时,对细胞培养上清中HBV DNA聚合酶的影响。No.322在30μg/ml浓度对HBV DNA聚合酶有抑制作用，抑制率为39.6±7.1％，大于3μg/ml浓度拉米夫定。
(5)黄酮类化合物 No.322对接种 HepG2.2.15细胞裸鼠大剂量组乙肝病毒HBsAg，HBeAg抗原抑制率分别为45.0±12.8%，10.0±4.2%；中剂量组 HBsAg抗原抑制率为18.8±8.6%。两组与模型对照组相比抗原抑制明显，但抑制率低于相同浓度拉米夫定。
(6)酶切鉴定图显示：重组质粒 pTAL-EnhⅠ-SEAP经限制性内切酶 MluⅠ，BglⅡ双酶切，所得片断大小与插入的目的片断HBV EnhⅠ大小一致。经北京优博基因科技有限公司测序，重组质粒pTAL-EnhⅠ-SEAP分子量5249bp，其中目的片段HBV EnhⅠ434bp,载体pTAL-SEAP4815bp，与Gene Bank中序列相吻合。
结论:
(1)对162个样品进行次初筛和复筛确认，得出有抗乙型肝炎病毒（HBV）活性的物质共42个。
(2)黄酮类化合物No.223、No.322在体外有强抗HBV作用。
(3)黄酮类化合物No.223、No.322在体外对HBV DNA拷贝数有影响。No.322在无毒浓度(50μg/ml)对HBV DNA拷贝数有显著抑制作用。
(4)黄酮类化合物No.322在30μg/ml浓度时，对 HBV DNA聚合酶抑制明显。判断HBV DNA聚合酶是本化合物作用靶点之一。
(5)黄酮类化合物No.322对接种HepG2.2.15细胞裸鼠HBsAg有抑制作用。
(6)建立一种HBX蛋白药物筛选模型。基于HBX蛋白的作用特点，PCR扩增选择性激活序列—— HBV EnhⅠ，插入到分泌型碱性磷酸酶（SEAP）报告基因表达载体上游，构建重组载体。
方法:选用阿德福韦为阳性药，用 MTT法检测样品对HepG2.2.15细胞的毒性，ELISA法检测细胞上清中HBsAg、HBeAg的变化，以细胞的半数毒性浓度(median toxic concentration,TC50)、半数抗原分泌抑制浓度(median infective concentration,IC50)、治疗指数（therapeutic index,TI）为指标，对162个样品进行初筛，筛选出有抗HBV活性样品，并进一步复筛确认。选择两个代表性的黄酮类化合物No.322、No.223进行初步构效关系研究。选用拉米夫定为阳性药用，实时荧光定量PCR法（Taqman探针法）观察其对HepG2.2.15细胞中HBV DNA拷贝数的影响。同位素法检测No.322对HBV DNA聚合酶的影响；用HepG2.2.15细胞接种裸鼠，观察样品对裸鼠血清HBsAg、HBeAg水平的影响。
构建检测 HBX蛋白的质粒：PCR扩增选择性激活序列—— HBV EnhancerⅠ，插入到分泌型碱性磷酸酶（secreted alkaline phosphatase,SEAP）报告基因表达载体上游，构建重组载体。与HBX蛋白共同转染哺乳动物细胞，建立利用微孔板检测抑制HBX蛋白活性化合物的细胞模型。
结果:
(1)对162个样品进行初筛和复筛，共筛选出21个样品TI在1～2之间，19个样品TI在2～10之间，2个化合物TI≥10。
(2)黄酮类化合物No.322 TC50>200μg/ml，对HBsAg和HBeAg分泌治疗指数分别是5.5±0.7和<1.0。No.223的TC50>200μg/ml，对HBsAg和HBeAg分泌治疗指数分别是4.3±0.7和<1.0。
(3)黄酮类化合物No.322、No.223在无毒浓度50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml时,观察其对HepG2.2.15细胞产生HBV DNA拷贝数的影响。当No.322在50μg/ml、25μg/ml两个浓度时HBV DNA拷贝数分别为0.7±0.6×105copy/ml，1.7±0.2×105copy/ml。当No.223在50μg/ml、25μg/ml两个浓度时HBV DNA拷贝数分别为3.9±0.6×105copy/ml，6.2±0.7×105copy/ml。
(4)黄酮类化合物No.322在30μg/ml、3μg/ml、0.3μg/ml浓度时,对细胞培养上清中HBV DNA聚合酶的影响。No.322在30μg/ml浓度对HBV DNA聚合酶有抑制作用，抑制率为39.6±7.1％，大于3μg/ml浓度拉米夫定。
(5)黄酮类化合物 No.322对接种 HepG2.2.15细胞裸鼠大剂量组乙肝病毒HBsAg，HBeAg抗原抑制率分别为45.0±12.8%，10.0±4.2%；中剂量组 HBsAg抗原抑制率为18.8±8.6%。两组与模型对照组相比抗原抑制明显，但抑制率低于相同浓度拉米夫定。
(6)酶切鉴定图显示：重组质粒 pTAL-EnhⅠ-SEAP经限制性内切酶 MluⅠ，BglⅡ双酶切，所得片断大小与插入的目的片断HBV EnhⅠ大小一致。经北京优博基因科技有限公司测序，重组质粒pTAL-EnhⅠ-SEAP分子量5249bp，其中目的片段HBV EnhⅠ434bp,载体pTAL-SEAP4815bp，与Gene Bank中序列相吻合。
结论:
(1)对162个样品进行次初筛和复筛确认，得出有抗乙型肝炎病毒（HBV）活性的物质共42个。
(2)黄酮类化合物No.223、No.322在体外有强抗HBV作用。
(3)黄酮类化合物No.223、No.322在体外对HBV DNA拷贝数有影响。No.322在无毒浓度(50μg/ml)对HBV DNA拷贝数有显著抑制作用。
(4)黄酮类化合物No.322在30μg/ml浓度时，对 HBV DNA聚合酶抑制明显。判断HBV DNA聚合酶是本化合物作用靶点之一。
(5)黄酮类化合物No.322对接种HepG2.2.15细胞裸鼠HBsAg有抑制作用。
(6)建立一种HBX蛋白药物筛选模型。基于HBX蛋白的作用特点，PCR扩增选择性激活序列—— HBV EnhⅠ，插入到分泌型碱性磷酸酶（SEAP）报告基因表达载体上游，构建重组载体。