【摘 要】
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目的:1.探究棕榈酸对成骨细胞的损伤作用。2.探究利拉鲁肽对棕榈酸导致的成骨细胞凋亡的保护作用及机制。方法:选取MC3T3-E1（小鼠成骨细胞系）细胞体外培养。（1）通过CCK-8、Western Blot、流式细胞术（FCM）以及荧光显微镜观察活性氧（ROS）以确定棕榈酸刺激的最佳时间和最佳浓度;（2）利用CCK-8、实时荧光聚合酶链式反应（q RT-PCR）确定利拉鲁肽作用的最佳时间和浓度;然
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目的:1.探究棕榈酸对成骨细胞的损伤作用。2.探究利拉鲁肽对棕榈酸导致的成骨细胞凋亡的保护作用及机制。方法:选取MC3T3-E1（小鼠成骨细胞系）细胞体外培养。（1）通过CCK-8、Western Blot、流式细胞术（FCM）以及荧光显微镜观察活性氧（ROS）以确定棕榈酸刺激的最佳时间和最佳浓度;（2）利用CCK-8、实时荧光聚合酶链式反应（q RT-PCR）确定利拉鲁肽作用的最佳时间和浓度;然后将细胞分为正常对照组（CON）、棕榈酸组（PA）、利拉鲁肽+棕榈酸组（Lira+PA）;分别用棕榈酸、利拉鲁肽+棕榈酸处理MC3T3-E1细胞,利用CCK-8检测细胞增殖率;细胞免疫荧光、Western Blot、q RT-PCR检测GLP1R表达水平;Elisa检测细胞内c AMP的变化;流式细胞术检测药物对细胞凋亡率的影响;并利用Western Blot检测关键蛋白p-PKA、p-β-Catenin（Ser675）、成骨标志物OPG/RANKL、C-Capase3、Bax、Bcl2的表达水平,q RT-PCR检测β-Catenin、PKA的m RNA表达水平。（3）探究利拉鲁肽对成骨细胞损伤的保护机制:（1）首先加入GLP1R抑制剂Exendin9-39:CCK-8检测抑制剂对细胞增殖速率的影响;Western Blot检测GLP1R/c AMP/PKA/β-Catenin信号通路以及成骨标志物和凋亡相关蛋白的表达水平,Elisa检测细胞内c AMP水平,荧光显微镜观察细胞内活性氧水平;q RT-PCR检测β-Catenin、PKA以及成骨标志物m RNA表达水平;细胞凋亡率用流式细胞术进行检测。（2）加入PKA抑制剂H89:CCK-8检测细胞增殖速率;Western Blot检测相关关键蛋白表达水平,q RT-PCR检测β-Catenin、PKA以及成骨细胞标志物的m RNA表达水平;流式细胞术检测其对细胞凋亡率的影响。结果:（1）通过CCK-8、Western Blot、流式细胞术及ROS结果确定棕榈酸刺激时间为24h,浓度为0.4m M。（2）根据CCK-8及q RT-PCR结果确定利拉鲁肽作用最佳浓度为100n M,与棕榈酸组相比,利拉鲁肽可改善因棕榈酸降低的细胞增殖速率,降低细胞凋亡率以及活性氧水平;升高了c AMP水平;上调了GLP1R的表达;p-PKA、p-β-Catenin（Ser675）、OPG、抗凋亡蛋白Bcl2水平升高,RANKL、凋亡关键蛋白Cleaved-Capase3（C-Capase3）和Bax的表达水平降低。（3）相较于Lira+PA组,Exendin9-39（100 n M）降低了细胞增殖率,GLP1R/c AMP/PKA/β-Catenin通路下调、细胞凋亡率升高,凋亡关键蛋白C-Capase3、Bax蛋白水平增高,Bcl2降低。PKA、β-Catenin、OPG、RANKL的m RNA水平表现出与蛋白表达相同的变化;Exendin9-39会再次升高细胞内活性氧水平。（4）相较于Lira+PA组,H89（20μM）下调了细胞增殖率;阻止了利拉鲁肽的保护作用,表现为:细胞凋亡率升高,p-PKA、p-β-Catenin（Ser675）、抗凋亡蛋白Bcl2表达水平下降,而凋亡关键蛋白C-Capase3和Bax的表达水平则呈现出相反的趋势。PKA、β-Catenin m RNA水平表现出与蛋白表达相同的变化,成骨活动和骨转换的重要标志OPG m RNA水平降低,而RANKL水平被上调。结论:利拉鲁肽可以保护成骨细胞由于过量的棕榈酸诱导的细胞凋亡增加,其作用机制可能是由于其与细胞GLP-1受体结合,激活G蛋白偶联受体GLP1R进而激活c AMP/PKA/β-Catenin信号通路发挥作用。
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