【摘 要】
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目的牙周炎是一种由菌斑微生物引起的慢性破坏性疾病,彻底消除炎症和获得组织再生是治疗牙周炎的理想目标。近年来,高脂血症与牙周炎的高度相关性为学者所共识,两者形成的恶性循环成为伴高血脂症性牙周炎治疗的难点。巨噬细胞是早期即参与牙周炎症反应的主要免疫细胞之一,涉及损伤和修复等过程。巨噬细胞的异质性和可塑性使其在复杂的局部环境中可极化为促进炎症发展的M1型和促进炎症消退的M2型,对巨噬细胞极化方向的调控是
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目的牙周炎是一种由菌斑微生物引起的慢性破坏性疾病,彻底消除炎症和获得组织再生是治疗牙周炎的理想目标。近年来,高脂血症与牙周炎的高度相关性为学者所共识,两者形成的恶性循环成为伴高血脂症性牙周炎治疗的难点。巨噬细胞是早期即参与牙周炎症反应的主要免疫细胞之一,涉及损伤和修复等过程。巨噬细胞的异质性和可塑性使其在复杂的局部环境中可极化为促进炎症发展的M1型和促进炎症消退的M2型,对巨噬细胞极化方向的调控是调节炎症反应的一种有效形式。牙龈间充质干细胞（Gingival mesenchymal stem cells,GMSCs）具有优越的免疫调节及降低血脂能力,在干细胞领域备受关注。外泌体作为细胞旁分泌的产物,具有细胞来源特异性。利用间充质干细胞外泌体为手段的无细胞疗法既可发挥干细胞的强大免疫调控能力,又规避了细胞治疗的弊端。因此本研究通过探讨牙龈间充质干细胞来源的外泌体（Gingival mesenchymal stem cells-derived exosomes,GMSCs-Exos）对高脂微环境中炎性巨噬细胞极化状态的影响,为伴高脂血症性牙周炎的治疗提供新的思路。方法通过酶消化法联合有限稀释法从健康的人牙龈结缔组织中分离培养GMSCs并鉴定。通过超速离心法,在GMSCs条件培养液中分离GMSCs-Exos,并通过纳米粒度分析仪,透射电子显微镜和蛋白免疫印迹实验分别对GMSCs-Exos的粒径,形态和表面标志物进行鉴定。诱导THP-1 24h使其分化为静息状态的巨噬细胞作为空白组。通过脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）/干扰素γ（Interferon-gamma,IFN-γ）与氧化型低密度脂蛋白（Oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL）联合刺激空白组巨噬细胞24h建立高脂的炎性巨噬细胞模型作为对照组。加入GMSCs-Exos与高脂微环境下的炎性巨噬细胞共孵育以构建实验组。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）比较巨噬细胞培养液中细胞因子浓度;流式细胞术分析巨噬细胞相关极化标志物的表达水平;实时荧光定量PCR检测巨噬细胞内M1/M2相关极化标志物的m RNA的表达水平;油红O染色评估巨噬细胞内脂质积累水平。结果使用酶消化法联合有限稀释法从牙龈结缔组织中成功获得GMSCs,细胞呈现出显著单克隆集落能力和及骨向和脂向细胞的分化潜能。流式细胞术分析示细胞高表达CD73、CD90和CD105,不表达CD45。超速离心法所获提取物在透射电镜下显示出外泌体典型的椭圆形杯状形态,阳性表达外泌体标志蛋白CD9、CD63、CD81和HSP70,粒径约为100nm。与空白组相比,对照组巨噬细胞的炎症标志物TNF-α、IL-1β和IL-6的m RNA表达明显升高（P<0.05）,抗炎及脂质调控相关基因PPAR-γ的m RNA表达水平显著降低（P<0.05）;流式细胞术分析示M1极化标志物CD86阳性率明显升高（P<0.05）;倒置显微镜下观察巨噬细胞内脂滴数量明显增加;ELISA分析上清液中炎症因子TNF-α的浓度显著提升（P<0.05）。与对照组相比,实验组巨噬细胞的炎症标志物TNF-α、IL-1β、IL-6的m RNA表达明显下调（P<0.05）,PPAR-γ和M2极化标志物IL-10的m RNA表达水平显著提高（P<0.05）;流式细胞术分析示CD86阳性率显著降低（P<0.05）,M2极化标志物CD163水平未发现明显改变（P>0.05）;巨噬细胞内脂滴数量显著减少,脂质积累水平明显降低（P<0.05）;巨噬细胞上清液中TNF-α的浓度显著下降,IL-10的浓度明显上升（P<0.05）。结论GMSCs-Exos抑制了高脂微环境中巨噬细胞的炎症反应和M1向极化,促进巨噬细胞M2向极化,调控巨噬细胞的脂质代谢。
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