旋毛虫（Trichinella spiralis）是一种人兽共患寄生虫,在食肉哺乳动物之间广泛传播,旋毛虫重度感染者可因心肌炎、脑炎、肺炎而死亡,其中心肌炎是最常见的旋毛虫致死病因。旋毛虫感染导致的心肌炎有两种可能,一种是旋毛虫幼虫从心肌一过性游走导致的直接性心肌炎,另一种是旋毛虫所分泌的物质导致的间接性心肌炎。热休克蛋白70（Hsp70）是旋毛虫一种重要的分泌蛋白,研究发现弓形虫Hsp70可使机体抗氧能力减弱,诱导肝细胞凋亡,但是旋毛虫Hsp70在凋亡中的作用研究还未见报道,基于此,本实验通过旋毛虫Ts-Hsp70体外刺激H9c2细胞,旨在探讨Ts-Hsp70是否能通过线粒体途径诱导H9c2细胞的凋亡,解析旋毛虫感染与宿主心肌细胞损伤的关系。本研究通过使用CCK-8试剂盒筛选Ts-Hsp70刺激H9c2细胞的最适浓度为60μg/mL,使用60μg/mL的Ts-Hsp70刺激H9c2细胞6 h、12 h和18 h后,通过对收集的细胞培养液检测发现,H9c2细胞经Ts-Hsp70刺激后会释放大量的LDH与CK,且LDH与CK的释放量随刺激时间的延长整体呈上升趋势,说明H9c2细胞经Ts-Hsp70刺激后细胞膜通透性发生了改变且细胞产生了损伤。在流式细胞检测中发现Ts-Hsp70刺激可导致H9c2细胞凋亡率增加,免疫荧光及分光光度法检测发现随刺激时间的延长Caspase-3活性整体呈上升趋势。以上结果初步确定Ts-Hsp70可诱导H9c2细胞发生凋亡。线粒体是心肌细胞的主要组成部分,研究认为氧化应激加重了心肌炎的自身免疫过程,基于此,本实验使用荧光探针DCFH-DA标记方法检测细胞中ROS的含量,结果显示H9c2细胞经Ts-Hsp70刺激后可释放大量ROS,同时,本研究也检测到Ts-Hsp70刺激后的H9c2细胞中GSH含量显著降低,表明心肌细胞氧化应激的发生。qPCR和Western-blot方法检测Bax与Bcl-2的基因转录水平与蛋白表达水平发现,随刺激时间的延长Bax基因转录水平与蛋白表达水平整体呈上升趋势,而Bcl-2基因转录水平与蛋白表达水平随刺激时间的延长整体呈下降趋势。膜电位的降低是细胞通过线粒体途径发生凋亡的的重要标志之一,在JC-10染色中发现Ts-Hsp70刺激能够引起H9c2细胞线粒体膜电位下降。因此,本研究继续通过Western-blot检测发现Ts-Hsp70刺激可导致线粒体中Cytochrome C释放及Caspase-9与Caspase-3的活化。以上实验结果说明Ts-Hsp70是通过线粒体途径调控H9c2细胞凋亡。为验证ROS的过表达与H9c2细胞线粒体凋亡有关,使用ROS抑制剂（NAC）预处理H9c2细胞,荧光探针DCFH-DA检测ROS的荧光强度,与Hsp70组相比较,NAC预处理组中ROS的荧光强度显著减弱,流式细胞仪检测发现细胞凋亡率显著降低,qPCR和Western-Blot方法检测发现Bax的基因转录水平及蛋白表达水平显著降低,而Bcl-2的基因转录水平及蛋白表达水平显著升高,同时发现Caspase-3活性显著降低,细胞活性显著升高。以上结果表明Ts-Hsp70激活ROS过表达从而介导线粒体途径调控的细胞凋亡。JNK信号通路可激活促进细胞凋亡的发生,已有研究发现细胞内源性ROS的增加是激活JNK途径重要诱因,基于此,本实验使用Western-blot检测JNK及p38蛋白磷酸化水平,发现JNK的蛋白磷酸化水平随刺激时间的延长整体呈升高趋势,而磷酸化的p38条带没有明显的改变。使用NAC处理H9c2细胞,Western-blot检测发现JNK蛋白磷酸化水平显著降低,表明ROS激活了JNK途径。加入JNK抑制剂（sp600125）后,Western-blot检测发现JNK蛋白磷酸化水平显著降低,qPCR及Western-Blot方法检测发现Bax的基因转录水平及蛋白表达水平显著降低,而Bcl-2的基因转录水平及蛋白表达水平显著升高。免疫荧光及Western-blot检测发现Caspase-3剪切活化水平显著降低,而细胞活性显著升高。以上研究结果共同证明Ts-Hsp70刺激H9c2细胞后引起ROS过表达激活JNK途径将凋亡信号下传导,引起下游线粒体凋亡途径激活导致H9c2细胞凋亡。本研究证明Ts-Hsp70刺激H9c2细胞后引发ROS过表达激活JNK途径将凋亡信号下传导,引起下游线粒体凋亡途径激活,导致Bcl-2与Bax的含量变化引起线粒体膜通透性增强,释放Cytochrome C,从而激活Caspase-9和Caspase-3,最终导致细胞凋亡,该研究结果对探究旋毛虫的发病机制和提供防治对策具有重要意义。