分泌表达PEDV中和抗体Fab片段的重组乳酸菌的构建及其抗病毒效应研究

来源 :东北农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:songxinda
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猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种高度接触性肠道传染病。患病猪主要表现为呕吐、腹泻、严重脱水等临床症状。不同日龄的猪均可感染发病,7日龄以内的新生仔猪致死率高达95%,对新生仔猪进行疫苗接种,难以在短时间内建立主动免疫,因此,针对新生仔猪进行疫苗接种无法及时建立主动免疫,利用抗体制剂进行预防或紧急治疗具有重要的科学意义。本实验利用乳酸杆菌组成型表达载体p PG-T7g10-PPT构建了分泌表达PEDV的中和抗体Fab片段重组乳酸杆菌表达载体p PG-T7g10-sp-Fab。将重组质粒电转化至猪源罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus ruteri)J31中,获得了重组乳酸杆菌p PG-T7g10-sp-Fab/J31。Western Blot检测结果表明,在重组罗伊氏乳酸杆菌p PG-T7g10-sp-Fab/J31的菌体和培养基中均可检测到PEDV中和抗体Fab片段的表达。酶联免疫吸附实验(ELISA)和间接免疫荧光实验(IFA)证明,重组罗伊氏乳酸杆菌p PG-T7g10-sp-Fab/J31表达的PEDV中和抗体Fab蛋白可与PEDV特异性结合。蚀斑减少实验证明了重组乳酸杆菌p PG-T7g10-sp-Fab/J31表达的PEDV中和抗体Fab蛋白对PEDV具有中和作用。为确定重组乳酸杆菌p PG-T7g10-sp-Fab/J31对PEDV感染仔猪的被动免疫保护作用,将6头新生仔猪平均分为2组,每组3头,一组口服重组乳酸杆菌p PG-T7g10-sp-Fab/J31,另一组为对照组,口服转化未表达抗体的空载体罗伊氏乳酸杆菌p PG-PPT/J31,连续灌服3 d后,将上述6头仔猪与感染PEDV的仔猪同笼饲养。每天记录每头仔猪的体重变化、临床症状,并每隔6 h采集仔猪鼻拭子、肛拭子,利用RT-PCR和q PCR方法检测仔猪排毒情况。同居饲养7 d后,将未死亡仔猪处死,解剖后观察肠道病理变化并进行肠道病理组织学检测。结果显示,6头仔猪与感染PEDV仔猪同居后均可感染PEDV,口服重组乳酸杆菌p PG-T7g10-spFab/J31仔猪在同居感染后存活率为100%,对照组仔猪与感染PEDV仔猪同居后第6 d死亡两头,且口服重组乳酸杆菌仔猪的临床症状、病理剖检变化、病理组织学变化与对照组相比均较轻微;对照组仔猪于同居后48 h即可在鼻拭子和肛拭子中检测到PEDV,口服重组乳酸杆菌p PG-T7g10-sp-Fab/J31仔猪排毒时间晚于对照组,且排毒量显著低于对照组。综上所述,本研究成功构建了可分泌表达PEDV中和抗体Fab片段的重组罗伊氏乳酸杆菌p PG-T7g10-sp-Fab/J31,p PG-T7g10-sp-Fab/J31表达的Fab蛋白具有PEDV中和活性,新生仔猪口服重组罗伊氏乳酸杆菌p PG-T7g10-sp-Fab/J31可减轻PEDV感染引起的临床症状、降低仔猪死亡率、减少排毒时间和排毒量。本研究结果为预防和紧急治疗PEDV感染提供了新的思路。
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