论文部分内容阅读
研究背景脂质代谢作为一种复杂且重要的生化反应,在细胞能量生成以及生物信号分子合成等方面发挥着关键作用。长链脂酰辅酶A合成酶（long-chain Acyl-Co A synthetases,ACSLs）是一种重要的脂质代谢酶,其作用是催化脂肪酸转化为脂酰辅酶A,ACSLs共包括五种同工酶,即ACSL1、ACSL3-6。相关研究提示ACSLs不仅可能参与糖尿病的发病机制,还与肺癌、肠癌等多种肿瘤的发生发展密切相关。放疗作为一种重要的抗肿瘤治疗手段,通过电离辐射（Ionizing radiation,IR）引起的氧化应激状态对肿瘤细胞造成损伤,常用于肺癌的综合治疗。由于肿瘤细胞的脂质代谢重编程,导致部分肺癌细胞存在放疗抵抗。因此,通过对肺癌细胞脂质代谢途径的干预,有望为增强放疗疗效提供一种新思路。我们前期实验发现,ACSL6可通过脂质代谢途径调控小鼠肺癌细胞的放射敏感性。因此,我们推测靶向调控人肺癌细胞ACSL6的表达,可能具有增强肿瘤放疗敏感性的潜在应用价值。目前未见有关该研究的国内外报道。因此,本文就ACSL6在人肺癌细胞电离辐射敏感性中的作用进行研究,首先从人源肺癌细胞水平明确ACSL6与人肺癌细胞电离辐射敏感性的关系,通过敲除ACSL6基因验证其对H460、BEAS-2B细胞辐射敏感性的影响。在此基础上,进一步对下游的分子作用机制进行分析,以筛选出ACSL6调节肺癌细胞辐射敏感性的作用分子。研究内容1、验证ACSL6基因对人肺癌细胞放射敏感性的调控作用。2、初步探讨ACSL6基因调控人肺癌细胞放射敏感性的机制。研究方法1、ACSL6基因对人肺癌细胞放射敏感性的调控作用（1）ACSL6基因敲除细胞的构建:以CRISPR Cas9技术构建H460、BEAS-2B细胞ACSL6基因敲除细胞系,然后筛选出稳定敲除目的基因的细胞株。（2）以人肺癌细胞系H460细胞为研究对象,人正常支气管上皮细胞BEAS-2B细胞作为对照,将细胞分为NC（阴性对照）和KO（基因敲除）两组。采用CCK-8法检测辐照后的细胞活力。采用流式细胞术检测细胞受照射后的凋亡水平,并利用Western blot实验检测辐照后细胞凋亡蛋白的表达水平。利用克隆形成实验检测照射后的细胞克隆集落数量,计算存活率,拟合生存曲线。通过细胞迁移实验检测照射后的细胞迁移能力。2、ACSL6基因调节人肺癌细胞放射敏感性的机制（1）利用流式细胞术和荧光显微镜检测细胞在照射后的活性氧水平。采用β-半乳糖苷酶染色法检测照射后的细胞衰老状态。采用流式细胞术对照射后细胞的周期分布进行检测。利用Western blot实验检测辐照后细胞周期蛋白的表达水平。（2）对照射后的细胞进行转录组和非靶向代谢组学分析。通过KEGG代谢通路进行关联,找到参与同一生物进程中发生显著性变化的基因和代谢物,进一步筛选锁定通路。（3）采用Western blot实验对目标通路的相关蛋白的表达水平进行检测,同时利用荧光显微镜检测细胞照射后的脂滴水平。研究结果1.ACSL6基因对人肺癌细胞放射敏感性的调控作用CCK-8结果显示,照射后的H460细胞KO组的细胞活力水平较NC组细胞下降,在24h和72h的KO组细胞活力水平下降更为显著（P＜0.05）。流式细胞凋亡检测显示,H460 KO组细胞的凋亡水平较NC组细胞的明显升高（P＜0.0001）。克隆形成实验显示H460细胞KO组的克隆形成能力降低,细胞增殖能力明显下降。细胞划痕实验显示H460细胞KO组在照射后12h、24h的迁移能力下降,其中12h下降明显（P＜0.05）。2.初步探讨ACSL6基因影响人肺癌细胞放射敏感性的机制流式细胞术活性氧检测实验显示,在照射后2h,H460细胞KO组的细胞ROS水平较NC组细胞明显升高（P＜0.001）。活性氧荧光显微镜检测显示,在照射后2h,H460细胞KO组细胞内的绿色荧光强度明显强于NC组（P＜0.01）。细胞衰老β-半乳糖苷酶检测显示,H460细胞KO组在照射后48h细胞衰老比例较NC组细胞明显升高（P＜0.01）。流式细胞术细胞周期检测显示照射后24h,H460细胞KO组细胞出现G1/S期阻滞。通过照射后24h的转录组和非靶向代谢组学结果进行差异基因和代谢物的KEGG自噬通路匹配,发现LC3基因表达下调,代谢物PE上调。Western Blot实验显示H460细胞KO组在照射后24h的自噬受到抑制。脂滴荧光检测显示照射后24h,H460细胞KO组的绿色荧光强度较NC组细胞明显减弱（P＜0.05）,提示ACSL6基因敲除后降低了H460细胞在辐照后的细胞脂滴数量。研究结论ACSL6基因对人肺癌细胞放射敏感性具有调控作用,敲除该基因的人肺癌细胞在辐照后出现细胞活力下降、凋亡率升高、增殖能力减弱和迁移能力降低。ACSL6基因对人肺癌细胞放射敏感性的调控作用与ROS生成、细胞衰老、细胞周期阻滞、自噬通路激活和脂滴合成等生物学过程有关。