脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）是一种危及生命的、毁灭性的损伤,可导致脊髓暂时或永久性改变,伴有部分或完全运动、感觉和自主神经功能的丧失,感觉功能障碍一般低于损伤水平。在全美每年影响约12000人,据估计,SCI在全球的患病率和发病率为236-4187/100万人,每年新增病例多达77万例,多见于30岁以下的男性,由于严重者可导致瘫痪,通常为截瘫或四肢瘫,会给患者和医疗服务系统带来严重的心理和经济负担。经过多年的研究,尽管对脊髓损伤的机制有了一定的了解,现有的治疗方法主要包括药物治疗、外科减压手术治疗和细胞治疗,但均无法获得令人满意的效果。随着基础实验的不断深入,我们通过实验发现人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,huc MSC）具有多向分化、增殖时间短、易于提取、移植后存活时间长等优点,被认为是移植干细胞进行细胞治疗的有利种子细胞,但是其移植后到达损伤核心区域比率有限,且干细胞所可能的致瘤性,进一步限制了其在临床中的应用。现在有研究结果表明,移植的干细胞主要通过旁分泌的功能发挥作用,而细胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）因其本身具有的特殊双层脂质膜结构可以轻松穿越血脑屏障,所以已经成为了最具研究价值的旁分泌分子。急性损伤发生时,巨噬细胞构成第一道防线,可以迁移到损伤部位,分泌炎症细胞因子,并吞噬异物。而在脊髓损伤后浸润性巨噬细胞和原位小胶质细胞一般3-7天达到高峰,后迅速分化为具有促炎作用的M1亚型,随着促炎性细胞因子进一步分泌,导致继发性损伤;另一方面,巨噬细胞和小胶质细胞也可以天然地极化为抗炎的M2表型,进而减少炎症反应。伴随着损伤后炎症的持续,另外一类细胞星形胶质细胞可能会在M1型小胶质细胞的作用下触发,引起A1表型星形胶质细胞的增殖和细胞瘢痕形成,这对周围的环境是有害的,但其一般在2周左右达到高峰。因此,M1和M2亚型之间的平衡可能成为SCI药物治疗的潜在靶点。有研究证明脊髓损伤的炎症状态下,由于炎症因子的激活释放过量的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）从细胞质释放到细胞外空间,进一步通过激活免疫细胞放大炎症免疫反应。细胞外ATP可在CD39的作用下迅速分解为一磷酸腺苷（adenosine monophosphate,AMP）,但AMP转化为腺苷的过程受到CD73（ecto-5′-nucleotidase）的限制,CD73作为细胞外AMP水解为腺苷的限速酶。是一种附着在质膜上的胞外核苷酸酶,可能影响嘌呤核苷酸代谢。然而,作为大分子其很难穿过血脑屏障（blood brain barrier,BBB）,同时具有可致肿瘤发生的可能,然而其对SCI的影响仍然未知。本实验旨在通过构建CD73修饰的人脐带间充质干细胞源的细胞外囊泡即CD73+huc MSC-EVs并进一步讨其在脊髓损伤后的抗炎作用及其可能的作用机制。第一部分:CD73过表达人脐带间充干细胞源的细胞外囊泡的提取与鉴定及其动物学实验研究目的:1.利用基因合成CD73序列,导入质粒筛选CD73过表达稳转株,分类收集细胞外囊泡并鉴定2.通过动物实验证明CD73+huc MSC-EVs的有效性方法:1.利用透射电子显微镜观察CD73+huc MSC-EVs的形态,利用NTA计算其半径大小;2.免疫印迹蛋白分析技术鉴定CD73+huc MSC-EVs;3.构建小鼠SCI模型应用BMS及BBB评分分析小鼠的行为;4.采用活体成像技术示踪长链的亲脂性二烷基碳菁类染料Di R标记的CD73+huc MSC-EVs,观察SCI后小鼠荧光分布情况了解其代谢途径;结果:1.CD73+huc MSC-EVs呈双凹盘状。NTA结果表明CD73+huc MSC-EVs直径约为100nm;2.Western blot结果显示:CD73+huc MSC-EVs表达特异性蛋白:CD73、CD63、CD81;3.动物行为分析中,从第7天开始,与模型组比较CD73+huc MSC-EVs治疗组其BMS和BBB评分均较高,p＜0.05;4.体内成像系统（IVIS）结果显示:Di R标记的CD73+huc MSC-EVs在T8-T9脊髓损伤的原位处中无荧光,而荧光主要分布在腹腔,且主要分布在肾脏及肝脏,证明CD73+huc MSC-EVs确实发挥作用,并通过肾和肝脏代谢;结论:我们通过工程化EVs建立了CD73+huc MSC-EVs药物载体并证明其在SCI小鼠上确实有效。第二部分:CD73过表达的人脐带间充质干细胞源的细胞外囊泡通过激活腺苷受体A2b及c AMP/PKA信号通路修复脊髓损伤目的:1.CD73+huc MSC-EVs是否可以促进M2/M1小胶质细胞极化,进而发挥M2型的抗炎作用;2.CD73+huc MSC-EVs发挥作用可能作用的受体和信号通路是什么;方法:1.利用H＆E,Tunel及Nissl染色分析脊髓细胞死亡及存活情况;2.免疫荧光标记一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,i NOS）和精氨酸酶1（arginase-1,Arg-1）分别作为M1和M2细胞的表面标记物,观察在CD73+huc MSC-EVs作用下M1/M2小胶质细胞的极化情况;3.利用A2a R和A2b R抑制剂敲除细胞来研究腺苷受体的激活情况;同时检测小胶质细胞的生物标志物和c AMP/PKA水平;4.重复的体内研究、形态染色、流式细胞术、细胞因子分析、ELISA检测用于验证。结果:1.H＆E染色,Tunel染色和Nissl染色表明,与SCI组相比,CD73+huc MSC-EVs治疗组神经死亡率低,且脊髓组织细胞的形态改善（p＜0.05）;2.针对M1的表面标记物i NOS和M2表面的标记物Arg-1免疫荧光显示,CD73+huc MSC-EVs组M2标记的Arg-1明显增多而M1标记的i NOs明显下降（p＜0.05）即促进了M2/M1小胶质细胞的极化;3.与CD73+huc MSC–EVs处理时,MRS1706（A2b R抑制剂）显著降低,而SCH58261（A2a R抑制剂）则不显著;同时sh RNA A2b R（short hairpin RNA adenosine A2b receptor）组和CD73+huc MSC-EVs处理后c AMP及PKA均下降,sh RNA A2b R组的Arg-1水平显著低于sh RNA干扰组,而sh RNA A2b R组的i NOS水平显著升高,同时M1 m RNA的表达标记（TNF-α,IL-1β和CD86）升高,而M2 m RNA的表达标记（Arg-1、IL-10和CD206）降低;4.流式细胞检测结果示:通过SCI+CD73+huc MSC-EVs组M2和M1小胶质细胞的生物标志物CD206和CD86计算M2:M1,其比值明显高于其他各组;细胞因子分析:SCI+CD73+huc MSC-EVs组促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1、IFN-α和MIP-1β显著降低,抗炎细胞因子如IL-4和IL-10显著升高;ELISA法检测脊髓损伤小鼠脊髓组织中检测验证因子释放情况,与SCI组比较,SCI+CD73+huc MSCEVs组TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高（p＜0.05）,重要的抗炎细胞因子IL-10水平显著降低。结论:CD73+huc MSC-EVs促进ATP羟基化为腺苷。CD73+huc MSC-EVs可通过激活A2b R/c AMP/PKA信号通路,改善脊髓损伤后的炎症反应,调节巨噬细胞/小胶质细胞M2:M1。