污水中酚类化合物对耐药基因水平转移的影响及潜在机理研究

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抗生素抗性基因(ARGs)作为新兴的环境污染物,对人类健康和生态安全构成严重威胁。而污水处理厂作为ARGs的重要储库,同时也是向环境中传播耐药性的重要场所,更令人担忧的是,污水中的某些污染物也会促进ARGs的传播。有大量研究发现,除抗生素外,一些非抗生素类污染物也可以通过促进ARGs的水平转移来传播耐药性,例如重金属、纳米粒子以及消毒剂等。目前,关于ARGs水平转移的研究主要集中在纯菌培养体系,其以可培养微生物为实验对象,只局限于单一供体细菌到单一受体细菌的水平转移。然而在实际应用中,污水处理厂活性污泥体系的微生物组成更加复杂,纯菌培养体系的结果往往难以解释实际活性污泥体系中ARGs转移的情况。众所周知,进入污水处理厂的污水(尤其是工业污水)中普遍包含各种酚类化合物,有研究表明,酚类化合物可能会导致废水处理生物反应器中ARGs丰度的增加,然而目前还尚未能很好地评估污水处理厂中酚类化合物对ARGs水平转移的影响。针对这一问题,本研究选取了三种典型的酚类化合物——对硝基苯酚(PNP)、对氨基苯酚(PAP)和苯酚(Ph OH),以携带RP4质粒(具有卡那霉素、四环素和氨苄青霉素多重耐药性)的大肠杆菌E.coli HB101作为供体菌,分别在纯菌体系和活性污泥体系下构建接合转移模型,通过平板计数、q PCR分析以及宏基因组学分析等方法,探究酚类化合物对ARGs水平转移的影响,并深入探究其作用机理,旨在为污水处理厂中ARGs传播的控制提供理论支撑,主要结论如下:(1)在纯菌体系中,以E.coli HB101为供体菌,构建属间和属内水平转移模型,在PNP、PAP和Ph OH胁迫下,探究RP4质粒的水平转移频率。结果表明,在10-100 mg/L浓度的PNP、PAP和Ph OH胁迫下都可以显著增加RP4质粒的属间和属内水平转移频率。另外,通过细菌培养和平板计数实验还发现接合质粒具有较高的稳定性,并且宿主细菌具有较高多样性,这意味着质粒水平转移会促进ARGs的广泛传播。(2)在实际污水处理厂活性污泥体系中,接种E.coli HB101作为供体菌,构建复杂体系下的接合转移模型,通过q PCR分析以及宏基因组学分析研究酚类化合物对RP4质粒接合转移的影响以及ARGs水平转移的潜力。首先,q PCR实验结果表明,PNP和Ph OH在10-100 mg/L浓度下,均促进了RP4质粒的接合转移,而PAP在10 mg/L浓度下有较为明显的RP4质粒转移促进效果。其次,宏基因组测序数据组装分析发现在实际污水处理厂活性污泥体系中,由于酚类化合物胁迫,促使存在于质粒上的ARGs占比大大增加,同时接合型质粒(conjugative plasmid)和可移动型质粒(mobilizable plasmid)的占比也有明显增加,这说明酚类化合物的胁迫增强了ARGs水平转移潜力。(3)为探究酚类化合物促进ARGs水平转移的潜在机理,我们从活性氧(ROS)的变化、细胞膜通透性的变化以及接合转移基因的表达水平等三个方面进行分析。结果表明,在不同浓度的PNP、PAP和Ph OH胁迫下,增加了供体和受体中ROS的产生,使细胞膜通透性增加,进而促进了ARGs的水平转移。另外,从接合转移基因m RNA的表达分析发现,PNP、PAP和Ph OH胁迫可以抑制RP4质粒上全局调控基因kor B和trb A的m RNA表达,并提高tra F基因的表达水平,进而促进RP4质粒的接合转移。
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