牙齿再生是目前口腔研究领域的热点之一。如何获得具有诱导成牙能力的种子细胞,是成功构建再生牙齿的核心环节。既往研究以牙齿再生为目标,报道了多种可参与再生牙齿构建的种子细胞。但是,若非借助牙胚来源的部分细胞或组织,研究人员尚无法实现仅基于成体获得的种子细胞的再生牙构建。因此,进一步地通过剖析发育过程中能发出成牙指令、或者具有诱导成牙潜能的牙胚细胞更全面的特征,将为明确再生牙构建所需的种子细胞的特征,提供最可靠的理论依据和实践基础。小鼠牙胚的发生发育主要历经牙板期、蕾状期、帽状期和钟状期等,是在BMPs、FGF、Wnts及SHH等信号家族调控下,一系列时空事件中上皮和间充质两层组织间相互作用的结果。本课题组前期通过单细胞转录组数据,对小鼠磨牙牙胚发育过程中,具有诱导成牙潜能的间充质细胞（蕾状期和钟状期的间充质细胞）进行了解析,发现分别受转录因子Barx1和Foxf1调控的两个高度活跃的基因调控网络（Gene regulatory networks,GRNs）,确定了与成牙相关的Barx1和与成骨相关的Foxf1在牙胚发育的各重要时期中的表达情况。此外,课题组发现细胞表面标记分子CD24a与Barx1存在共同表达区域,且在发育晚期（钟状期）存在着一群主要分布于牙乳头上半部分的强表达CD24a的间充质细胞。这群细胞是否是发育晚期具有诱导成牙潜能的牙胚间充质中最核心,最有效的发出指令的细胞群,尚待展开系统性研究。本研究首先通过免疫组化法,明确了CD24a对应的蛋白形式CD24在钟状期磨牙胚（Embryonic day 16.5,E16.5）的分布情况类似于CD24a的表达位置,进而通过流式细胞术检测了CD24在E16.5磨牙牙胚间充质细胞中的阳性率情况,发现存在CD24强阳(CD24++)、CD24弱阳（CD24+）以及CD24阴性（CD24-）等三个细胞群,所占比例分别是40%、36%、3.1%。我们在小鼠新生1天（Postnatal1,PN1）的磨牙牙胚间充质细胞中同样观察到了这三个细胞群,所占比例分别是7.4%、20%、17.8%。为了进一步明确以CD24为分选标志的这三个细胞亚群在牙齿发育过程的功能,我们一方面对比了CD24++细胞组和CD24+细胞组的牙源性基因表达水平,q PCR检测结果显示,Barx1、Bmp4、Lef1、Pax9和Wif1等牙源基因在CD24++细胞组中呈现较高的表达水平。另一方面,我们根据CD24的表达分布,针对E16.5的磨牙牙胚间充质,采用流式分选法获得CD24++和CD24+细胞群,并通过经验切割法获得相应分布位置的牙乳头上半部分（Dental papilla,DP1）和下半部分DP2,进而分别通过与牙源或非牙源上皮的重组实验验证细胞亚群的诱导成牙潜能。结果显示,CD24++和CD24+两组细胞在与E16.5牙源上皮重组后的成牙率分别是79.41%（n=27/34）和23.08%（n=6/26）;在与非牙源的E10.5第二鳃弓上皮重组后的成牙率,则分别是16.7%（n=1/6）和0%（n=0/5）。这说明CD24++细胞组相对于CD24+细胞组,呈现了显著的诱导成牙能力的优势。对应CD24强阳细胞分布的DP1组（64.52%,n=20/31）,在重组实验中相对于对应CD24弱阳细胞分布的DP2组（23.81%,n=5/21）,同样表现出较高的成牙率,以及较高的诱导成牙潜能。我们进一步通过将PN1时期分选获得CD24++和CD24-细胞直接移植到特定脱细胞基质的猪牙本质（Tooth dentin matrix,TDM）的中空腔内培育,发现前者形成功能组织模块（牙髓牙本质复合体）的牙向分化潜能呈现显著优势。此外,我们还利用了micro-CT和免疫组化方法,明确了CD24++组能够形成形态相对较好、牙齿体型较大的牙齿。综上所述,在牙胚发育晚E16.5的牙源间充质细胞存在以CD24为标志的细胞群,不仅具有显著的诱导上皮组织共同成牙的潜能,还具有向牙本质牙髓复合体分化的潜能。本研究的结果明确了以CD24为标志的牙胚间充质细胞亚群,是牙胚晚期间充质中发出成牙指令的核心细胞群,具有决定牙向分化命运的潜能。这是首次对磨牙胚发育过程中的细胞亚群的高分辨率图谱描绘和功能解读,为牙齿再生的间充质种子细胞的明确特征,提供了科学依据。