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〖背景〗风湿性心脏病是典型的受环境因素和个体因素共同影响的疾病之一,其本身是儿童时期急性风湿热的后遗症,而风湿热由链球菌感染引起。决定风湿热和风心病易感性的因素不但与链球菌的接触及链球菌感染后的预防有关,而且与个体自身的免疫遗传易感性有关。研究风湿性心脏病的遗传易感性和环境易感性,从而为风湿性心脏病的个体化预防与治疗提供依据,在我国等发展中国家具有一定的社会意义。本实验研究定位于风湿性心脏病发病与一个先天性免疫分子甘露糖结合凝集素(MBL)基因及其表达产物变异性之间的关系。MBL本身具有特异性识别和结合病原微生物的能力,与引起风湿热和风心病的甲组乙型溶血性链球菌有强大的亲和力,通过激活补体系统和调理吞噬来杀伤病原体。先天性缺乏MBL的儿童容易发生反复感染,因此我们推测风湿性心脏病的易感性可能与先天性MBL水平低下有关。已经知道MBL在基因水平有单核苷酸序列多态性,在外显子序列和启动子序列上有多个点突变,造成个体之间MBL含量和质量的巨大差异,这种差异会不会影响到个体对风湿性心脏病易感性,是本研究的目的所在。除此之外,我们还研究了基因工程合成MBL的可能性和采用MBL基因在动物体内表达MBL的可能性,从而为MBL基因及其蛋白应用于临床治疗提供了初步的实验结果。 〖第一部分〗人MBL的纯化与兔抗人MBL抗血清的制备 目的 从混和人血浆中提取并纯化人MBL蛋白,制备兔抗人MBL抗血清。方法采用亲和层析法提取纯化人MBL蛋白,SDS-PAGE及薄层凝胶扫描鉴定其纯度;SDS-PAGE电泳后切下其32KD蛋白条带免疫新西兰兔,获取兔抗人MBL抗血清,ELISA方法和Western blot方法鉴定其效价和特异性。结果从500mL混和人血浆中获得MBL蛋白427μg,经SDS-PAGE后薄层扫描鉴定其纯度为72%;人MBL蛋白免疫新西兰兔,获得兔抗人MBL 刃口旱巨大学俗士学位论文 抗血清,ELISA方法测定其效价为 1:3200,Western blot方法鉴定该抗血清 能够特异性识别入J缸浆中MBL蛋白,在32KD蛋白分子量处获得单一条带。 结论我们成功地从混和人血浆中提取纯化了人M旧L蛋白,制备了较高效价 和特异性的兔Jk/- MBL抗血清,为研究MBL相关性疾病提供了研究工具。 K第二部分B甘霎糟结合凝集素血清浓度与凤湿性心赃病的关系 目的探讨风湿性,C脏病与MBL血清浓度之间的关系。方洁EMSA法 检测的例风湿性心脏病病人和引例正常人的血清 MBL浓度,进行统计学 分析。结果风。C病病人和正常人的年龄及性别构咸无差异,血清MBL浓度 分别为1.15土0*3 m叭和1.52上0.93 <叭八P<0刀5)。将病人以平均症状出 现年龄为界分为大小两个年龄组,发现大年龄组血清MBL浓度为1.49 t O.79 m叭,而卜年龄组血清**L浓度为0.82土O.SO m叭八P<0.01)。结论血清 MBL水平低下可能是风湿性心脏病的一个易感因素,同时也是病情发展的 促进因素。 区第三部分习凤湿性心脏病病人心脏组织中回BL样沉积物观赛 目的调查风心病患者心脏乳头肌和瓣膜组织中有无MBL样物质的沉 积。方洁免疫组织化学方法和 Western blot法。结果 自行制备的兔抗人 MBL 多克隆抗血清对人乳头肌组织产生非特异性染色,对瓣膜组织无染色。 Western blot未检测到乳头肌组织中有持异性蛋白条带的出现。结论 MBL及 其激活的补体系统可能没有参与慢性风湿性·。脏病的。。脏组织损害。 R第四部分】甘露糖结合凝集素基因点突变与凤湿性心赃病易感性 目的探讨风湿性。C脏病易感性与甘露糖结合凝集素基因第一外显子点 突变的关系。方洁 采用匹R和MLP对36例临床慢性风湿性心脏病病人 和39例正常人M旧L等位基因分布情况进行分析。结果病人组及正常人组 均未发现有 MBL C和 D等位基困的出现。11/36例患者为 MBL As等位基 困杂合子,l/36例患者是 MBL B/B等位基因纯合子。15/39例正常人为 MBL AM等位基因杂合子,未发现有 MBL B用等位基因纯合子。X‘分析未发现 显著差异。进一步分析表明,携带B等位基困的风湿性心脏病病人平均症状 出现年龄为30.O t uj岁,AA纯合子病人的平均症状出现年龄为36.7。n3 岁,有显著差异(P<O刀5)。全组病人的平均症状出现年龄为33.5岁,以此 3 第口旱巨大学傅士学位论文 为界将病人分为2组,小发病年龄组病人中B等位基因的出现频率为10/19, 而大发病年龄组病人的 B等位基因出现频率为 2/17,?