【摘 要】
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研究背景和目的:皮肤创面愈合是一个高度程序化的病理生理修复过程,而免疫响应在其中必不可少,尤其是表皮γδ T细胞和巨噬细胞等参与的皮肤屏障免疫。近年来,血小板递送的免疫调控信号广受关注。尽管血小板衍生物如血小板活化后上清（PAS）及血小板来源细胞外囊泡（PDEVs）被认为是促进皮肤创伤愈合的有效治疗手段,但该过程所涉及的表皮γδ T细胞和巨噬细胞的生物学行为改变及机制仍未阐明。而嘌呤能信号通路（C
【基金项目】
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国家自然科学基金（8217223）；
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研究背景和目的:皮肤创面愈合是一个高度程序化的病理生理修复过程,而免疫响应在其中必不可少,尤其是表皮γδ T细胞和巨噬细胞等参与的皮肤屏障免疫。近年来,血小板递送的免疫调控信号广受关注。尽管血小板衍生物如血小板活化后上清（PAS）及血小板来源细胞外囊泡（PDEVs）被认为是促进皮肤创伤愈合的有效治疗手段,但该过程所涉及的表皮γδ T细胞和巨噬细胞的生物学行为改变及机制仍未阐明。而嘌呤能信号通路（CD73-A2AR轴）参与的免疫调控有助于抑制炎症。本研究通过观察PAS对小鼠表皮γδT细胞（树突状表皮T细胞,DETC）的作用,初步探索血小板调控创面免疫的嘌呤能信号通路机制,并延伸至更具有成分筛选性的PDEVs和更具有时序性调控的巨噬细胞,初步阐明PDEVs对巨噬细胞极化的作用,以及PDEVs加速创面愈合的免疫调控机制。研究方法:1、建立小鼠全层皮肤缺损模型,并给予创面PAS处理,利用流式细胞术检测小鼠皮肤造创后第1天和第3天创缘表皮中DETC的富集情况,并检测CD44、CD103、yδ TCR、IGF-1、CD73 的表达分布情况。2、利用蔗糖垫密度超速离心法制备PDEVs,并利用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析、Western Blot和纳米流式技术对PDEVs的形态、粒径、标志物表达（CD9、CD63、TSG101）和分群（CD9+、CD63+、CD81+）进行鉴定。3、利用Western Blot、ELISA和免疫荧光技术检测PDEVs对脂多糖（LPS）刺激下的小鼠Raw264.7巨噬细胞极化的影响。4、在糖尿病小鼠上建立全层皮肤缺损模型,并给予创面PDEVs处理,利用创面大小分析、H＆E和Masson胶原染色、免疫组织化学技术、免疫荧光技术、Western Blot检测分析PDEVs对糖尿病小鼠创面愈合速度和质量的影响,以及探索巨噬细胞和嘌呤能信号通路（CD73-A2AR轴）参与的免疫调控机制。结果:1、在造创后第1天,PAS显著促进了 DETCs向创缘表皮富集,提高了 γδTCR、CD44和CD103在创缘表皮DETC上的表达水平。但在造创后第3天,PAS组的DETC富集水平、γδ TCR、CD44和CD103的在创缘表皮上DETC的表达水平均显著低于对照组。无论是造创后的第一天还是第三天,PAS组的IGF-1+DETC数量均少于对照组。在造创后的第二天,PAS增加了 CD73在DETC和其它表皮细胞上的表达。2、本研究所制备的PDEVs具备外泌体的特征,且是一群高表达CD9（67.9%）、CD63（32.8%）而低表达CD81（7.75%）的细胞外囊泡群。3、PDEVs抑制了 LPS刺激下巨噬细胞M0向M1的极化,并缩短了 M1巨噬细胞响应LPS的炎症功能持续时间。4、PDEVs激活了创面的嘌呤能信号通路CD73-A2AR轴,促进巨噬细胞从M1向M2的表型与功能转变,抑制促炎因子表达,增强抗炎因子表达,促进糖尿病小鼠创面血管生成,加速创面愈合,改善胶原沉积,提高愈合质量。结论:本研究发现血小板活化上清可快速富集和活化DETC,并初步寻找到嘌呤能信号通路关键酶CD73作为血小板免疫调控靶点,进而将机制延伸至PDEVs的研究,初步阐明了 PDEVs可抑制巨噬细胞的M1极化,并促进创面愈合过程中巨噬细胞从M1向M2的表型与功能转换;PDEVs可激活创面愈合过程中的嘌呤能信号通路CD73-A2AR轴,提示该信号轴可能是PDEVs调控皮肤创伤微环境的潜在免疫调控机制。
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