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三七花是传统名贵中药五加科植物三七(Panax notoginseng (Burk)F.H.Chen)的伞状花序。90%以上产于云南省文山壮族苗族自治州,在八个县均有分布,其中文山县、邱北县种植较多。民间将三七花作为高血压病人常用的保健和治疗用品,历时已久。
本课题前期对其进行了防治高血压病的新药研究,研究结果显示三七花所含的总皂苷具有良好的降压效果。但关于三七花药材的质量标准仅在《广西省药材标准》中收载,且只有性状和人参皂苷Rb1的薄层鉴别,相关文献报道也较少。故本文通过对三七花进行指纹图谱和含量测定的研究,以完善其质量标准,同时体现三七花作为一味中药在成分上的复杂性和多变性。
在三七花指纹图谱研究中,以人参二醇型皂苷为指标,对药材的提取溶剂、提取方法、提取时间等进行了考察,最终确定以甲醇为提取溶剂,索氏提取法提取2小时并用AB-8大孔吸附树脂纯化。通过研究,得到最佳HPLC色谱条件为:色谱柱:Kromasil C-18柱(2504*4.6mm,5um);流动相:0-140min 乙腈-水梯度洗脱;柱温:25℃;流速:0.5ml/min;检测波长:203nm;进样量:5ul。以三七花所含人参皂苷Rb3为参照峰,对14种不同产地、不同生长年限的三七花药材进行HPLC指纹图谱的研究,方法学考察结果表明,各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%,重现性良好,供试品溶液在24小时内稳定,仪器精密度良好,自动匹配的结果显示各指纹图谱的相似度大于0.90,符合指纹图谱研究技术的要求。14种不同产地、不同生长年限的三七花药材指纹图谱的相关系数(与对照图谱相比)依次为:0.84,0.86,0.6,0.866,0.859,0.586,0.603,0.862,0.852,0.572,0.492,0.565,0.573,0.861,各共有峰的保留时间接近,但峰面积差别较大,提示不同药材所含的同种化学成分的含量有差异显著。除共有特征峰外,每个药材出现其独有的色谱峰,形成了药材之间的差异。对两批中试样品的药材-半成品-制剂的指纹图谱分析结果显示,14批三七花药材指纹图谱所得的15个共有特征峰能绝大部分在半成品和制剂的图谱中重现,且半成品和制剂主要成分的种类和含量差异不大,表明三七花药材-半成品-制剂之间的质量稳定性和同一性比较好。所建的HPLC指纹图谱不仅体现药材的“共性”和“个性”,为不同产地、不同生长年限三七花药材的鉴别及质量评价提供了科学依据,同时也体现药材、半成品、制剂之间的质量稳定性和同一性。
在含量测定研究中,对三七花所含总皂苷、人参皂苷Rb1和Rb3进行了含量测定。以人参二醇为指标,采用香草醛-冰醋酸法测定总皂苷含量,方法学考察结果为:人参二醇的回归方程为Y=0.0092X/2+0.0329(r=0.998),平均回收率为100.001%(RSD=0.13%,n=6);重现性试验、样品稳定性试验和精密度试验的RSD分别为0.24%、2.0%和0.64%;结果表明,人参二醇在26.5ug-84.8ug范围内有良好的线性关系,该法重现性良好,供试品溶液在分析浓度下7小时内稳定,仪器精密度良好。14批样品所含总皂苷含量测定的结果表明:不同产地、不同生长年限的三七花的总皂苷含量差异较大。以人参皂苷Rb1和Rb3为指标,用HPLC法测定了三七花所含单体皂苷Rb1和Rb3的含量。色谱条件为:色谱柱:Kromasil C-18柱(250*4.6mm,5um);流动相:0-55min乙腈-水梯度洗脱;柱温:25℃;流速:0.5ml/min;检测波长:203nm;进样量:10-25ul。方法学考察结果为:Rb1和Rb3的回归方程分别为Y=461.95X-14.846(r=0.9999)和Y=562.4X+8.5654(r=0.9999),平均回收率分别为99.16%(RSD=0.95%,n=6)和102.62%(RSD=2.75%,n=6),重现性试验RSD分别为0.33%和0.47%,样品稳定性试验RSD分别为0.96%和1.05%,精密度试验RSD分别为0.12%和0.48%,结果表明,Rb1和Rb3分别在0.348ug-4.35ug,1.26ug-15.75ug范围内有良好的线性关系,该法重现性良好,供试品溶液在分析浓度下48小时内稳定仪器精密度良好。HPLC含量测定结果表明:不同产地、不同生长年限的三七花中单体皂苷含量差异较大。由于总皂苷的含量多少与两个单体皂苷的含量并不是完全对应,故建议对三七花的质量评价综合考虑总皂苷含量和单体皂苷含量。
综上,本文通过对三七花HPLC指纹图谱和含量测定的研究,为制订三七花较为完善的质量标准以及新药开发奠定基础。