论文部分内容阅读
Eomesodermin(Eomes)是含有T-结构域的转录因子家族成员,在效应T细胞和记忆T细胞分化及功能介导的调节中发挥重要作用。记忆T细胞主要包括更易循环至外周淋巴组织的中枢记忆T细胞(Central memoryT cells,TcM)和受到刺激可快速分化成效应T细胞的效应记忆T细胞(EffectormemoryT cells,TEM)。最近新发现了一群CD8+记忆T细胞亚群,称为组织原位记忆T细胞(Tissue resident memory T cells,TRM),是组织区域免疫中的重要效应细胞群体。Eomes高表达抑制皮肤和肺中TRM细胞形成,Eomes的下调表达对TRM细胞的分化至关重要。整联蛋白CD103是TRM细胞的经典表面标志,是白细胞归巢到特定外周组织的重要分子。CD103通过与其配体E-钙粘蛋白的相互作用,介导细胞粘附、迁移和信号传递。并且,CD103可直接促使CD8+CTL细胞释放穿孔素和颗粒酶,从而增强抗肿瘤免疫应答。肿瘤微环境中丰富的转化生长因子-β(TGF-β)可以诱导CD8+T淋巴细胞表面CD103的表达。CD103+CD8+TRM细胞是组织区域免疫中抗肿瘤免疫应答的重要效应细胞群体,其在肿瘤组织的浸润程度与多种肿瘤的预后相关。CD4+Th9细胞来源的IL-9在肺腺癌和黑色素瘤等实体瘤中具有抗肿瘤特性。CD8+Tc9细胞的可塑性使得其能够分化成可长效地产生IFN-y的Tcl样效应细胞。Th9和Tc9细胞赋予细胞过继免疫治疗新的策略与途径。课题组前期研究发现,小鼠IL-33能增强肿瘤微环境中CTL和NK细胞的浸润;IL-33协同IL-12可增强体外培养的人CD4+T细胞和CD8+T细胞的效应功能;IL-33可作用于体外培养的鼠的CD4+Th9细胞,促进其IL-9的分泌。鉴此,本课题借助Eomes KO小鼠,探讨Eomes基因在IL-33介导的肿瘤免疫应答中的作用及其可能的机制,并进一步探讨Eomes在IL-33调节体外培养的鼠CD4+Th9、CD8+Tc9细胞的效应功能中的作用,以期为CD4+Th9以及CD8+Tc9细胞在细胞过继免疫治疗的潜在应用提供理论依据和新的思路。第一部分:Eomes在IL-33介导的肿瘤免疫应答中的作用及机制研究[目的]探讨Eomes在IL-33介导的肿瘤免疫应答中的作用及其可能的机制。[方法]以WT鼠为对照,借助Eomes基因缺失(Knock Out,KO)小鼠,构建B16和B16-IL-33黑色素瘤荷瘤小鼠模型,记录肿瘤大小,绘制肿瘤生长曲线,观察小鼠生存状况,绘制生存曲线;在肿瘤接种第18天,采用免疫荧光标记和流式细胞术检测分析肿瘤微环境免疫细胞群体的浸润及其效应功能;经Real-time PCR检测肿瘤生长不同时期肿瘤组织各分子mRNA水平的表达变化。[结果]1、与WT小鼠相比,B16肿瘤生长在Eomes KO小鼠无明显差异,但B16-IL-33肿瘤生长在Eomes KO小鼠明显受抑延缓,差异具有统计学意义(P<0.05),荷瘤小鼠生存时间延长,差异具有统计学意义(P<0.05);2、Eomes基因缺失增强了 IL-33介导的肿瘤微环境中IFN-y、perforin、Granzyme BmRNA水平表达,差异具有统计学意义(P<0.05);3、Eomes基因缺失促进IL-33介导的肿瘤微环境中IL-12、IL-15 mRNA水平的表达,差异具有统计学意义(P<0.05);4、Eomes基因缺失增加了小鼠肿瘤微环境中CD1 03+CD8+TRM细胞的浸润,差异具有统计学意义(P<0.05),对CD69的表达无影响;5、Eomes基因缺失上调IL-33介导的肿瘤微环境中IL-9、TGF-β mRNA水平的表达,差异具有统计学意义(P<0.05);6、在接种B16-IL-33肿瘤细胞的第29天,在第一次接种肿瘤细胞的腹部对侧再次接种B16-IL-33肿瘤,EKO组的肿瘤生长明显小于WT组,最终肿瘤完全消退。[结论]Eomes基因缺失增强了 IL-33介导的抗肿瘤作用,明显抑制荷瘤小鼠肿瘤生长,延长荷瘤小鼠生存时间,可能通过进一步促进IL-33介导的肿瘤微环境中CD103+CD8+TRM细胞亚群的浸润,以及上调IL-33介导的肿瘤微环境中IL-9的表达,进而增强抗肿瘤效应,但其确切的机制仍需进一步深入探讨。第二部分:Eomes在IL-33调节体外培养的鼠CD4+Th9、CD8+Tc9细胞的效应功能中的作用[目的]探讨Eomes在IL-33调节体外培养的鼠CD4+Th9、CD8+Tc9细胞的效应功能中的作用,以期为CD4+Th9以及CD8+Tc9细胞在细胞过继免疫治疗中的应用提供理论依据和新的策略。[方法]经磁珠分选富集WT和Eomes KO小鼠脾脏来源的CD4+和CD8+T细胞,在有/无细胞因子 IL-33 存在下,经 CD3 mAb(5 μg/ml)+CD28 mAb(5 μg/ml)+IL-2(20U/ml)+mIL-4(10 ng/ml)+mTGF-β(1ng/ml)+anti-IFN-γ(10μg/ml)(Th9 or Tc9)极化条件培养72h后,收集细胞,在有/无细胞因子IL-33存在下再继续培养4h,收集培养不同时间点的各组细胞,经Real-time PCR分析IFN-y、IL-9等分子mRNA水平的表达;同时,在细胞培养24、48、72h以及再刺激4h这4个时间点,收集细胞培养上清,经ELISA检测IFN-y、IL-9的分泌;在细胞培养48h,收集细胞,经免疫荧光标记和流式细胞术检测IL-9的表达。[结果]1、在IL-33调节体外培养的鼠CD4+Th9细胞分化活化中,Eomes基因缺失进一步增强IL-33 对 IL-9、IFN-γ、GranzymeA、TGF-β、PU.1、IRF4、CCL20、CCR6 等分子表达的上调,差异具有统计学意义(P<0.05);2、在IL-33调节体外培养的鼠CD8+Tc9细胞分化活化中,Eomes基因缺失进一步增强 IL-33 对 IL-9、IFN-γ、GranzymeA、TGF-β、PU.1、IRF4、CCL20、CCR6 等分子表达的上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。[结论]在小鼠CD4+T细胞向Th9极化过程中,Eomes基因的缺失进一步增强细胞因子IL-33对IL-9、TGF-β、PU.1以及IRF4的上调作用,促进CD4+T细胞向Th9极化并分泌IL-9。另外,Eomes基因的缺失能进一步增强细胞因子IL-33对IFN-y、GranzymeA的上调作用,促进CD4+Th9的效应功能。在小鼠CD8+T细胞向Tc9极化过程中,得到相似结果,提示Eomes基因缺失能促进CD8+T细胞向Tc9极化,增强细胞效应功能。这为CD4+Th9以及CD8+Tc9细胞在细胞过继免疫治疗中的应用提供潜在的思路。