p53肿瘤抑制蛋白是癌症的基础研究中的一个重要的分子。在细胞DNA发生轻微损伤时,为避免把这种损伤传给子代细胞,p53行使细胞周期抑制的功能,为细胞进行DNA损伤修复提供时间,以保证子代细胞DNA的完整性;当细胞DNA损伤严重而无法修复时,p53可以激活细胞的凋亡信号通路,使细胞发生凋亡,以清除那些功能紊乱或不可修复的损伤细胞。然而在大部分的肿瘤中p53都是突变或者是功能缺失的。p53突变后不仅不能监控基因组的完整性,还会获得癌基因功能。获得功能的p53突变能够促进细胞增殖,促进细胞转化,引发癌症。突变p53的作用机制大约分为四种:a.突变p53直接作用于靶基因启动子,促进或者抑制靶基因转录;b.突变p53与其他转录因子结合或募集其他转录因子调控靶基因的转录;c.突变p53还能够与其他转录因子或者辅助因子结合,来使这些因子脱离与DNA的结合;d.突变p53结合目的蛋白,增强或者封闭它们的功能,间接影响靶基因转录。突变p53能获得癌基因功能的最强有力的证据,来源于转基因小鼠的研究结果。具有突变型p53等位基因的小鼠通常比具有野生型p53基因的小鼠更快的发展各类型的癌症。例如,分别对TP53的内含子4以及外显子5,外显子2-6基因敲除后,基因型为Trp53+/-和Trp53-/-的小鼠将会罹患淋巴瘤和肉瘤,提示我们p53是重要的抑癌基因;基因敲入R172P突变的转基因小鼠将会罹患淋巴瘤和肉瘤;基因敲入R172H突变的转基因小鼠将会罹患淋巴瘤和肉瘤等恶性肿瘤,并且容易发生转移,这提示我们突变p53的获得性功能。本课题所研究的p53N236S（p53S）敲入小鼠是本实验室构建的p53N236S转基因小鼠模型。对p53S敲入小鼠的研究中发现:基因型为p53S/S的小鼠在大约三个月左右就会罹患肿瘤,十个月左右小鼠几乎全部死于肿瘤。前期实验中:对基因型为p53S/S的小鼠进行电离辐射后对小鼠胸腺组织的细胞凋亡和周期抑制相关蛋白进行检测后发现:基因型为p53S/S的小鼠已经丧失了转录调控p21,puma等p53下游分子的能力。本实验室的前期实验研究还发现:p53S在不改变总Akt蛋白表达上调的情况下,可以上调Akt蛋白的磷酸化激活。这提示我们p53S可能与导致Akt磷酸化的激酶存在相互作用。我们知道Akt能够在PI3K-Akt-mTOR信号通路起到关键作用,PI3K-Akt-mTOR信号通路能够促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,还能够影响肿瘤的侵袭于浸润,与细胞存活有着非常密切的关系。本文通过对小鼠MEF细胞的蛋白表达量检测发现,基因型为P53S/SMEF细胞的 Akt-mTOR 通路相关蛋白:p53、P-p53ser15、P-p53ser392、P-AktSer473、mTOR、P-mTORSer2448、P-mTORSer2481、Rictor、Raptor 等较基因型为 WTMEF和基因型为p53S/+MEF要高;在随后进行的MTT实验检测三种MEF细胞的增殖情况中,我们发现在48h内,p53S/SMEF细胞的增殖速率最快。这提示我们p53突变蛋白p53S在小鼠p53S/SMEF细胞中表达量增加,进而对Akt-mTOR通路有上调的作用,导致细胞异常增殖。接下来,以p53N236S转基因小鼠自发的肿瘤为材料,对小鼠自发肿瘤进行了肿瘤细胞的原代培养,我们成功培养了 4株基因型为p53S/S的原代肿瘤细胞株,并对其进行了蛋白表达量检测及细胞增殖率的检测。以p53-/-MEF细胞为阴性对照,以p53S/SMEF细胞为阳性对照进行蛋白表达量检测后发现,在原代培养的小鼠肿瘤细胞中,p53蛋白及P-p53ser15、P-p53ser392的蛋白表达量较阳性对照p53S/SMEF细胞有所升高;在小鼠肿瘤细胞中Akt-mTOR通路相关蛋白:Akt、P-AktSer473、mTOR、P-mTORSer2448、P-mTORSer2481、Rictor、Raptor 等蛋白表达量较对照组同样有所升高;接下来以野生型小鼠MEF细胞为对照,对小鼠肿瘤细胞进行了 MTT细胞增殖检测,发现原代培养的小鼠肿瘤细胞增殖率在12h后迅速增加,较对照组WT MEF细胞增殖率高。这提示我们可能在原代培养的肿瘤细胞中由于突变p53蛋白p53S的表达量增加导致细胞中Akt-mTOR通路高度激活,引起细胞异常增殖。基于以上结果,我们猜想,如果p53S真的在细胞中对PI3K-Akt-mTOR信号通路进行着正调控,那么如果p53S在细胞中的表达量下降了,会导致什么情况发生呢?所以接下来,我们对小鼠肿瘤细胞进行了 p53的敲低,我们发现敲低p53后的小鼠肿瘤细胞p53蛋白以及P-p53ser15、P-p53ser392的蛋白表达量较未被敲低的小鼠肿瘤细胞蛋白表达量低。而P-AktSer473、P-AktThr308、mTOR、P-mTORSer2448、P-mTORSer2481、Rictor、Raptor 的蛋白表达量也有所降低。接下来,在以未被敲低p53的小鼠肿瘤细胞为对照的MTT检测细胞增殖率的实验中发现,敲低p53后的小鼠肿瘤细胞增殖率下降了。这说明p53S是调控小鼠肿瘤细胞中Akt-mTOR通路的关键蛋白,其对Akt-mTOR通路有上调作用,导致细胞异常增殖,将其敲低,引起这条通路的相关蛋白表达量下降,细胞增殖速率也随之下降。综上所述,本论文研究发现,p53S能够使小鼠MEF细胞和小鼠肿瘤细胞中Akt-mTOR 通路的相关蛋白如 P-AktSer473、mTOR、P-mTORSer2448、P-mTORSer2481、Rictor、Raptor的表达量上调,进而导致细胞的异常增殖。对小鼠肿瘤细胞进行p53的成功敲低后,小鼠肿瘤细胞中Akt-mTOR通路的相关蛋白 P-AktSer473、P-AktThr308、mTOR、P-mTORSer2448、P-mTORSer2481、Rictor、Raptor的表达量下调,而细胞的增殖率也有所降低。上述结果提示我们:在细胞水平,p53S可以通过调控Akt-mTOR通路来调控细胞的增殖。说明p53S不仅丧失了对p53下游分子的调控功能,还获得了对下游增殖信号通路进行调控的功能。以上细胞水平实验为后期p53S在小鼠肿瘤组织水平对Akt-mTOR通路的调控作用研究提供了线索。本文研究结果显示在肿瘤细胞增殖的过程中,p53S起到了非常重要的调控作用。而p53S突变蛋白在肿瘤细胞中的高表达可以使其与正常细胞区别开来,成为肿瘤分子靶向治疗的特异性靶点。本文显示的p53S对Akt-mTOR通路的调控作用,为肿瘤靶向治疗的多靶点治疗同样提供了新的思路。