论文部分内容阅读
目的:探究依达拉奉右莰醇对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠的神经保护作用及其抗氧化、抗炎机制。方法:将40只雌性C57BL/6小鼠采用随机数字表法分为正常对照组、EAE模型组、依达拉奉右莰醇干预组及依达拉奉干预组,每组10只。采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55（MOG35-55）多肽对后三组小鼠进行免疫制备EAE动物模型,正常对照组不处理。自造模次日开始依达拉奉右莰醇干预组腹腔注射依达拉奉右莰醇12.5 mg/kg（12.5 mg/10 ml）,依达拉奉干预组腹腔注射依达拉奉10 mg/kg（10 mg/10 ml）,而正常对照组与EAE模型组腹腔注射生理盐水10 ml/kg,1次/天,连续注射14天。行神经功能障碍评分,并记录各组小鼠活动、摄食、毛发、体重等情况。发病小鼠于发病高峰期处死,未发病小鼠及正常对照组小鼠观察至造模后28天处死。分别采用HE染色、LFB染色观察脊髓实质中炎性细胞浸润及脱髓鞘现象;采用比色法和化学荧光法检测脑组织匀浆中丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）含量;采用黄嘌呤氧化酶法和紫外分光法检测脑组织匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）及过氧化氢酶（CAT）活性;采用实时荧光定量PCR检测脑组织匀浆中白细胞介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子α（TNF-α）m RNA表达水平;采用蛋白免疫印迹法检测脊髓组织中核因子E2相关因子2（Nrf2）、血红素加氧酶-1（HO-1）及核因子κBp65（NF-κBp65）蛋白表达水平。结果:（1）各组小鼠发病情况:正常对照组小鼠均未发病;其余各组小鼠不同程度发病;与EAE模型组小鼠发病潜伏期（8.60±0.96）d相比,依达拉奉右莰醇干预组和依达拉奉干预组发病潜伏期（10.62±0.74）、（9.44±0.88）d明显延长,依达拉奉右莰醇干预组延长更明显（P＜0.05）。与EAE模型组小鼠发病进展期（6.40±0.96）d相比,依达拉奉右莰醇干预组和依达拉奉干预组发病进展期（4.25±1.03）、（5.33±0.70）d明显缩短,依达拉奉右莰醇干预组缩短更明显（P＜0.05）。与EAE模型组小鼠发病高峰期神经功能障碍评分（3.55±1.01）相比,依达拉奉右莰醇干预组和依达拉奉干预组发病高峰期神经功能障碍评分（1.75±0.84）、（2.66±0.61）明显降低,依达拉奉右莰醇干预组最低（P＜0.05）。（2）各组小鼠组织病理改变:正常对照组小鼠脊髓组织无异常;EAE模型组小鼠发病高峰期可见脊髓实质内大量炎性细胞浸润,脊髓白质可见大片白色脱髓鞘区域,脊髓组织严重肿胀及空泡形成;依达拉奉右莰醇干预组及依达拉奉干预组脊髓组织炎性细胞浸润情况及脱髓鞘情况较EAE模型组有所减轻,依达拉奉右莰醇干预组最轻。（3）各组小鼠MDA和ROS含量比较:发病高峰期,正常对照组、EAE模型组、依达拉奉右莰醇干预组及依达拉奉干预组小鼠脑组织匀浆中MDA含量分别为（1.21±0.38）、（6.38±0.49）、（2.26±0.35）、（3.44±0.29）nmol/mg.pro,ROS含量分别为（361.90±58.24）、（695.05±46.67）、（468.96±27.05）、（584.69±66.12）ηnmol/mgpro。EAE模型组、依达拉奉右莰醇干预组及依达拉奉干预组MDA和ROS含量较正常对照组均显著升高（P＜0.05）,依达拉奉右莰醇干预组及依达拉奉干预组MDA和ROS含量较EAE模型组均显著下降,依达拉奉右莰醇干预组下降更明显（P＜0.05）。（4）各组小鼠SOD和CAT活性比较:发病高峰期,正常对照组、EAE模型组、依达拉奉右莰醇干预组及依达拉奉干预组小鼠脑组织匀浆中SOD活性分别为（25.99±3.82）、（7.47±2.40）、（18.45±1.41）、（13.14±2.76）U/mgpro,CAT活性分别为（5.47±0.47）、（0.74±0.30）、（3.96±0.18）、（1.76±0.28）U/mgprot。EAE模型组、依达拉奉右莰醇干预组及依达拉奉干预组SOD及CAT活性较正常对照组均显著降低（P＜0.05）;依达拉奉右莰醇干预组及依达拉奉干预组SOD及CAT活性较EAE模型组均显著升高,依达拉奉右莰醇组升高更明显（P＜0.05）。（5）各组小鼠Nrf2和HO-1蛋白表达水平比较:发病高峰期,正常对照组、EAE模型组、依达拉奉右莰醇干预组及依达拉奉干预组小鼠脊髓组织中Nrf2蛋白相对表达量分别为（0.12±0.03）、（0.28±0.04）、（0.69±0.06）、（0.45±0.06）,HO-1蛋白相对表达量分别为（0.10±0.03）、（0.29±0.03）、（0.90±0.07）、（0.58±0.04）。EAE模型组、依达拉奉右莰醇干预组及依达拉奉干预组Nrf2及HO-1蛋白表达较正常对照组均显著升高（P＜0.05）;依达拉奉右莰醇干预组及依达拉奉干预组Nrf2和HO-1蛋白表达较EAE模型组均显著升高,依达拉奉右莰醇干预组升高更明显（P＜0.05）。（6）各组小鼠IL-1β、TNF-αm RNA表达水平比较:发病高峰期,正常对照组、EAE模型组、依达拉奉右莰醇干预组及依达拉奉干预组小鼠脑组织匀浆中IL-1βm RNA表达水平分别为（0.98±0.14）、（3.03±0.21）、（1.71±0.31）、（2.31±0.45）,TNF-αm RNA表达水平分别为（1.05±0.11）、（3.51±0.40）、（1.75±0.23）、（2.31±0.27）。EAE模型组、依达拉奉右莰醇干预组及依达拉奉干预组IL-1β、TNF-αm RNA表达水平较正常对照组均显著升高（P＜0.05）;依达拉奉右莰醇干预组及依达拉奉干预组IL-1β、TNF-αm RNA表达水平较EAE模型组均显著降低,依达拉奉右莰醇干预组降低更明显（P＜0.05）。（7）各组小鼠NF-κB p65蛋白表达水平比较:发病高峰期,正常对照组、EAE模型组、依达拉奉右莰醇干预组及依达拉奉干预组小鼠脊髓组织中NF-κB p65蛋白相对表达量分别为（0.06±0.02）、（0.53±0.04）、（0.18±0.05）、（0.3±0.05）。EAE模型组、依达拉奉右莰醇干预组及依达拉奉干预组NF-κB p65蛋白表达较正常对照组均显著升高（P＜0.05）;依达拉奉右莰醇干预组及依达拉奉干预组NF-κB p65蛋白表达较EAE模型组均显著降低,依达拉奉右莰醇干预组降低更明显（P＜0.05）。（8）相关性分析:EAE模型组、依达拉奉右莰醇干预组及依达拉奉干预组小鼠发病高峰期神经功能障碍评分与脑组织匀浆中MDA和ROS含量呈正相关（P＜0.05）,与脑组织匀浆中SOD和CAT活性及脊髓组织中Nrf2和HO-1蛋白表达水平呈负相关（P＜0.05）,与脑组织匀浆中IL-1β、TNF-αm RNA表达水平及脊髓组织中NF-κB p65蛋白表达水平呈正相关。结论:（1）EAE发病高峰期存在氧化还原失衡,MDA、ROS含量增加,抗氧化酶SOD、CAT活性降低,氧化应激损伤可能是EAE发生发展的重要原因之一。（2）EAE发病高峰期存在炎症损害,促炎细胞因子IL-1β及TNF-α水平升高,炎症损害与EAE进展密切相关。（3）依达拉奉右莰醇可以延长EAE小鼠发病潜伏期、缩短进展期、降低高峰期神经功能障碍评分,减轻脊髓组织中炎性细胞浸润及脱髓鞘程度,且作用效果强于依达拉奉,提示依达拉奉右莰醇对EAE小鼠具有神经保护作用,且保护作用效果强于依达拉奉。（4）依达拉奉右莰醇对EAE小鼠的神经保护作用强于依达拉奉的原因可能是依达拉奉右莰醇具有抗氧化和抗炎双重作用,其对Nrf2/ARE通路及NF-κB通路具有更强的调节能力。