研究目的： 利用免疫磁珠分离法获取人脐血血管内皮祖细胞，进行培养、诱导分化、鉴定的研究；利用肿瘤组织建立血管内皮祖细胞体外促募集、分化模型，双向蛋白电泳分析其促血管内皮祖细胞募集、分化的蛋白成分。 研究内容和方法: 第一部分人脐血来源血管内皮祖细胞体外培养、分化和鉴定特性研究在剖腹产过程中采集胎盘端的脐带血，采用密度梯度离心法获取脐带血中的单个核细胞；分别利用CD34和CD133免疫磁珠试剂盒进行分选，获取CD349<+>、CD133<+>血管内皮祖细胞，行台盼蓝染色鉴定细胞活性，流式细胞仪检测脐血中CD34<+>、CD133<+>细胞含量和所获取的CD34<+>、CD133<+>细胞纯度；分别用EBM-2培养液培养CD34<+>、CD133<+>细胞，观察血管内皮祖细胞生长、分化情况，培养7天后，进行DIL-LDL和FITC-LECTIN摄取实验、CD34和Ⅷ因子免疫组化鉴定，将刚分离获取的、培养4天、培养7天的CD34<+>和CD133<+>细胞和HLNECs分别行体外血管生成实验，比较CD34<+>和CD133<+>血管内皮祖细胞的生长特性；分别用EBM-2培养液培养CD34<->和CD133<->细胞，观察免疫磁珠分选后剩余细胞生长、分化情况，培养7天后行CD34和Ⅷ因子免疫组化鉴定；分别将CD34<+>细胞和单核细胞冻存于液氮中，分别于冻存3、6、12、18个月时复苏细胞，行台盼蓝染色鉴定细胞活性，分别进行培养，培养7天后行CD34和Ⅷ因子免疫组化鉴定及形成内皮细胞集落计数，比较不同冻存时间对血管内皮祖细胞活性及增殖能力的影响。 第二部分人脐血来源血管内皮祖细胞体外促募集、分化模型建立使用DMEM培养液培养人肝癌BEL-7402细胞，将BEL-7402细胞消化后，重悬于PBS液中，按10<7>个细胞/只的量注射于10～14g的雌性裸鼠颈后皮下部位；观察裸鼠注射位置的肿瘤生长情况；当肿瘤组织生长达直径1cm，即行手术切除肿瘤组织；实验组中，将部分肿瘤组织行石蜡切片及HE染色检查；将肿瘤组织切成2mm小块，置于Transwell上室培养，下室接种免疫磁珠分选获取的CD133<+>细胞，进行共培养，对照组中则不加入肿瘤组织进行培养，期间分别收集两组培养液，冻存待用；两组使用同一培养液培养至7天，分别行DIL-LDL和FITC-LECTIN摄取实验、CD34和Ⅷ因子免疫组化鉴定。 第三部分促血管内皮祖细胞募集、分化的蛋白研究将上一步分所获取的两组培养液，分别进行蛋白质超滤浓缩、去除高丰度蛋白及蛋白纯化；再经蛋白定量后，进行CyDye荧光标记，蛋白加样进行常规2-DE和2D-DIGE分离。2-DE凝胶深紫荧光染色来检测蛋白质斑点，使用ImageMaster软件进行表达图谱分析；2D-DIGE凝胶中预先被Cydye染料标记的蛋白质斑点，经多功能激光扫描仪不同波长的激光扫描后，获取荧光胶内差异表达图谱，使用DeCyder软件分析。 研究结果: 1.CD34<+>和CD34<+>细胞数量、纯度及细胞活性经密度梯度离心法获取的单核细胞中，经流式细胞仪检测CD34<+>细胞和CD133<+>细胞含量为(1.18±0.84)﹪、(1.15±0.086)﹪，经免疫磁珠分选获取的两者数量为(7.27±0.69)× 10<6>、(9.26±0.47)× 10。，经流式细胞仪鉴定两者纯度为(79.43±2.62)﹪、(91.45±1.04)﹪，经台盼蓝染色鉴定两者活细胞百分比为(94.85±2.36)﹪、(91.4±2.01)﹪。 2.CD133<+>、CD34<+>细胞体外培养特性培养24h内细胞全部贴壁生长。细胞逐渐形成梭形。在培养5～7d，团状生长的梭形血管内皮细胞形成局部典型的集落。 行Dil-LDL及FITC-Lectin摄取实验，结果经显微镜观察绝大部分细胞均可见为双染阳性。CD34<+>细胞双染阳性率与CD133<+>细胞两组行t检验，无显著差异。行细胞免疫组化检测CD34及Ⅷ因子表达情况，结果大多数细胞均阳性表达CD34及Ⅷ因子。CD34<+>细胞和CD133<+>细胞及HLJVECs组间每100个细胞平均阳性率比较均无显著差异。 体外血管生成实验结果：①刚分离的CD34<+>和CD133<+>细胞无明显管状结构形成；②培养4天后的CD34<+>和CD133<+>细胞可形成少数管状结构，两者无显著差异；③培养7天的CD34<+>和CD133<+>细胞形成较多管状结构，两组无显著差异；④HUVECs接种后形成管状结构，分别与培养1w的CD34<+>细胞和CD133<+>细胞进行比较，结果无显著差异。 3.CD133<->细胞及CD34<->细胞体外培养特性部分细胞逐渐胞体伸展、变大，逐渐形成梭形。细胞形态呈多样化，有圆形、梭形等细胞贴壁生长。在培养5～7d，可见团状生长的梭形血管内皮细胞形成局部典型的集落。分别行细胞免疫组化检测CD34及Ⅷ因子表达情况。结果仅少数细胞阳性表达CD34及Ⅷ因子。 4.冻存对于EPCs影响的比较冻存3、6、12、18个月的单核细胞和CD34<+>细胞复苏后，经台盼蓝染色，结果示不同冻存时间对于两种细胞的活细胞比例没有明显的影响；不同冻存时间的单核细胞和CD34<+>细胞复苏后，经体外培养，结果示不同冻存时间对于两种细胞的集落形成数量有影响；两种细胞形成的梭形细胞经免疫组化证实为阳性表达CD34和Ⅷ因子。 5.裸鼠肿瘤组织模型建立Bel-7402细胞注射至裸鼠皮下，3～6天后可于裸鼠皮下有结节生成，随着观察时间推移，皮下结节也随着增大。经石蜡切片和HE染色后显微镜下观察，所获取的肿瘤组织的细胞学形态与恶性肿瘤相近似。 6.肿瘤促血管内皮祖细胞分化实验组可见EPCs形成梭形，并有梭形细胞集落形成，行Dil-LDL及FITC-Lectin摄取实验：Dil-LDL、FITC-Lectin摄取实验示大部分细胞均可见为双染阳性，免疫组化实验示大部分细胞呈阳性；对照组的EPCs贴壁生长后，大部分细胞没有明显形态变化，仅有少量细胞胞体伸展、变长，没有细胞集落形成。 Dil-LDL及FITC-Lectin摄取实验及免疫组化实验仅少部分细胞阳性；两组间差异显著。 7.双向蛋白电泳分析促EPCs募集、分化蛋白2D-DIGE分析结果进行MALDI-TOF-MS鉴定，成功鉴定出71种差异蛋白质，从中筛选出属于实验组组上调的蛋白质7类：表皮生长因子受体相关蛋白、PDZand LIM domain protein 5、ETS-1蛋白、热休克蛋白60、顺乌头酸酶、G蛋白偶联受体6。 结论: 1.CD34和CD133标记的免疫磁珠分选法是高效获取EPCs的有效途径； 2.CD34<+>和CD133<+>血管内皮祖细胞体外培养特性相近； 3.体外冻存时间影响血管内皮祖细胞的分化能力； 4.利用Transwell系统可成功建立肿瘤组织促血管内皮祖细胞募集、分化模型； 5.2D-DIGE是灵敏度和可信度非常高的蛋白质组学分离、检测技术，是寻找和鉴定促EPCs募集、分化作用蛋白质的有效方法； 6.表皮生长因子受体相关蛋白、PDZ and LIM domain protein 5、ETS-1蛋白可能具有促EPCs募集、分化的作用； 7.热休克蛋白60、顺乌头酸酶、G蛋白偶联受体6可能参与EPCs分化的代谢过程。