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目的:虾类是导致食物过敏的主要原因之一,在食物过敏患者中的流行率为2.8%～8%。随着近些年来贝类消费量的不断增加,免疫球蛋白E(Ig E)介导的贝类过敏对儿童和成人造成的健康威胁日益严重。原肌球蛋白是甲壳类海产品的主要致敏组分,基于原肌球蛋白的组分诊断可以显著提高虾过敏的诊断准确度。当下大多数过敏蛋白的研究是通过直接从生物中提取出的,但是天然提取过敏蛋白不仅过程繁琐复杂,提取过程中容易掺杂其他非过敏原组分,而且有些重要过敏原蛋白含量较少,不易提取。重组蛋白可以避免这些缺陷,但需要确定其免疫学活性。本研究的目的是重组表达、纯化虾类主要过敏原-原肌球蛋白Pen a1及通过光激化学发光的方法(LICA)评估其免疫活性。方法:1.原肌球蛋白Pen a1基因合成根据已知的Pen a1序列人工合成Pen a1基因、设计合成特异性引物,并对其进行PCR扩增,鉴定PCR扩增结果。2.重组表达质粒p ET-28a(+)-Pen a1的构建首先目的基因Pen a1与载体p ET-28a(+)分别进行双酶切;然后进行核酸电泳,凝胶回收;最后在DNA连接酶的作用下,构建重组表达质粒p ET-28a(+)-Pen a1。将构建好的重组质粒转化至感受态Top10中,进行培养并进行PCR鉴定,选择阳性克隆菌液送测序。测序比对正确的质粒,进一步进行Bam HI-Hind III双酶切验证。3.重组过敏原蛋白Pen a1的表达、纯化重组质粒导入表达宿主E.coli BL21(DE3)中。培养过夜后,IPTG诱导表达。获得重组过敏蛋白Pen a1,镍柱纯化表达产物。用质谱检测为进一步验证该蛋白。4.重组过敏原蛋白Pen a1的免疫学活性评估血清过敏原特异性Ig E(s Ig E)检测采用光激化学发光均相法(light-initiated chemiluminescent assay,LICA)。首先,在96孔板中依次加入25μL用含有1%人血清白蛋白(HSA)的PBS(p H 7.4,0.01 mol/L)稀释(1:20)的贝类过敏患者的血清,50μL(1:1000,稀释液:PBS/HSA)抗人Ig E抗体标记的发光球和1μg/L的生物素化Pen a1溶液,37℃震荡孵育30 min。随后,加入150μL链霉亲和素标记的感光球,反应混合物在37℃避光条件下震荡孵育10 min。最后,在LICA仪器上检测化学发光信号(chemiluminescence,CL)。同时将健康人血清平行处理作为阴性对照。每份血清样本复孔检测。结果:1.原肌球蛋白(Pen a1)基因的PCR扩增鉴定将合成的目的基因经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳后,所得目的片段的大小约为930 bp(加上保护碱基及酶切位点),与理论预测值相符。2.重组表达质粒p ET-28a(+)-Pen a1的验证部分样品的菌落PCR扩增结果约为930 bp,与预测大小930 bp相符,说明目的基因成功连接到质粒载体上。同时阳性克隆菌的正向与反向测序结果显示所得序列与NCBI上所公布的Pen a1序列一致。此外将测序正确的菌落摇菌培养,提取质粒并进行双酶切,获得的条带约867 bp、5400 bp与预期867 bp、5400 bp的大小一致。酶切结果表明获得了含Pen a1基因的重组质粒。3.目的蛋白的表达、纯化及鉴定IPTG诱导培养,SDS-PAGE电泳结果显示在36 k Da处出现一条明显增多的蛋白条带,分子量与预测值相符,且未诱导的菌体中未明显出现该条带。该目的蛋白主要出现在超声波处理后的上清液中产生,所以为可溶性表达。镍柱纯化后,SDS-PAGE电泳结果显示获得了单一纯化的目的蛋白。此外经进一步质谱鉴定,该目的蛋白为原肌球蛋白。4.血清Ig E抗体与原核表达产物Pen a1的结合能力采用LICA技术检测重组Pen a1过敏原结合贝类过敏患者血清Ig E抗体的结合能力。71.4%(25/35)的患者血清s Ig E抗体对重组Pen a1过敏原敏感,与已有的文献报道类似,说明该重组过敏原具有来良好的过敏原性。结论:通过对试验方法的探索和试验条件的优化,建立了原肌球蛋白Pen a1重组表达及评估其免疫学活性的方法;同时成功表达、纯化出的原肌球蛋白Pen a1,为进一步更好的研究Pen a1在贝类动物(如虾类)过敏的诊断和治疗中作用奠定基础。