论文部分内容阅读
目的:山莴苣素是毛菊苣中天然存在的倍半萜内酯类化合物,具有多种药理活性。本研究首次探讨山莴苣素对FFA诱导的HepG2细胞脂肪变性的影响及脂质代谢的调节作用;同时,探究山莴苣素对细胞自噬的影响以及其发挥降脂功能与诱导自噬的关系,从而为NAFLD预防及治疗提供新的思路。方法:(1)通过CCK-8法和形态学观察法检测山莴苣素对细胞活力的影响;FFA诱导HepG2细胞构建NAFLD体外模型,结合油红O染色、TG和TC定量及Western Blot法检测山莴苣素对脂质积聚的影响;同时,利用试剂盒检测各组细胞内氧化应激、ROS水平及线粒体膜电位变化;利用Western blot法检测脂质代谢相关蛋白并结合HSL抑制剂检测细胞内TGs含量变化。(2)采用RNA-seq技术分析山莴苣素对FFA诱导的HepG2细胞脂肪变性转录组信息,深入挖掘其发挥作用的关键信号通路及靶基因并通过qRT-PCR及Western Blot法在分子水平上验证。(3)利用激光共聚焦显微镜、透射电镜及Western Blot法检测山莴苣素对HepG2细胞内自噬体形成和LC3Ⅱ蛋白表达水平的影响,并借助溶酶体抑制剂Baf A1评价自噬流情况;Western Blot法检测山莴苣素干预HepG2细胞后p-AMPK和p-mTOR表达水平的变化;运用3-MA抑制自噬水平后,结合油红O染色、TG定量和Western Blot法检测山莴苣素对FFA-HepG2细胞内脂肪含量的影响。结果:(1)山莴苣素对HepG2细胞无毒剂量范围在0-20μM;与空白对照组相比,FFA-HepG2细胞内脂滴数目、TG、TC含量及MDA含量及ROS水平显著升高(P<0.01),而SOD活性、GSH含量及线粒体膜电位显著降低(P<0.01);山莴苣素干预FFA-HepG2细胞后,与FFA组相比,细胞内脂滴数目、TG、TC和MDA含量及ROS水平显著降低(P<0.01)而SOD活性、GSH含量及线粒体膜电位显著升高(P<0.01);在脂质代谢关键蛋白中,山莴苣素干预FFA-HepG2细胞显著增加HSL蛋白表达,而HSL蛋白激活被抑制之后,山莴苣素干预组中TGs大量积累(P<0.05)。(2)转录组测序数据中筛选出差异表达基因,并对每组差异表达基因进行通路分析,发现模型组和山莴苣素干预组中差异表达基因主要富集在NAFLD疾病信号通路和AMPK信号通路;对已有的NAFLD相关疾病靶点与山莴苣素干预组中的核心基因进行映射,筛选出关键靶基因HADHA和SQSTM1/p62;FFA-HepG2细胞中,SQSTM1基因的mRNA表达水平上调,而山莴苣素干预则下调了其表达,然而对于HADHA基因的表达,在FFA组明显下调,山莴苣素作用后显著上调,并HADHA蛋白表达也同样验证了此结果(P<0.05);与FFA模型组相比山莴苣素干预处理明显增加FAβO活性(P<0.0001);山莴苣素作用于FFA-HepG2细胞后使AMPK的磷酸化水平显著上调(P<0.01),同时Dorsomorphin与山莴苣素共处理FFA-HepG2细胞后,AMPK的磷酸化水平无显著变化。(3)山莴苣素干预后,较空白对照组,自噬体形成数目明显增多,LC3Ⅱ蛋白表达显著升高(P<0.001);山莴苣素与Baf A1同时作用于HepG2细胞后,较单独使用,进一步显著增加LC3Ⅱ蛋白表达水平(P<0.01);山莴苣素干预HepG2细胞后,细胞内p-AMPK/AMPK表达量显著升高,而p-mTOR/mTOR表达量显著降低(P<0.05);自噬水平被抑制后,与FFA模型组相比,山莴苣素干预组细胞内TGs含量恢复至与模型组相当的水平。结论:在FFA诱导的体外脂肪变性模型中,山莴苣素改善细胞脂质积聚、氧化应激水平及线粒体功能障碍,表现出良好的药理活性;作用机制一方面表现为山莴苣素通过促进脂质分解从而将脂解产生的游离脂肪酸β氧化减少脂肪的积累,另一方面表现为山莴苣素通过诱导自噬参与减少脂滴的过程。