【摘 要】
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目的:N6甲基腺苷（m6A）修饰是mRNA内部丰度最高的修饰,其动态修饰过程和生物学功能由甲基转移酶（writer）、去甲基酶（eraser）和识别蛋白（reader）共同调控。FTO（Fat mass and obesity-associated protein）是 m6A 修饰的主要去甲基酶,具有促进肿瘤发生发展的功能,且已有多种研发成功的小分子抑制剂。然而,FTO在急性T淋巴细胞白血病（T-
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目的:N6甲基腺苷（m6A）修饰是mRNA内部丰度最高的修饰,其动态修饰过程和生物学功能由甲基转移酶（writer）、去甲基酶（eraser）和识别蛋白（reader）共同调控。FTO（Fat mass and obesity-associated protein）是 m6A 修饰的主要去甲基酶,具有促进肿瘤发生发展的功能,且已有多种研发成功的小分子抑制剂。然而,FTO在急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）细胞中的表达、功能及作用机制尚无文献报道。本论文旨在研究FTO在T-ALL细胞中的表达和功能、解析FTO的作用机制,并评价FTO小分子抑制剂的抗T-ALL效能。方法:（1）通过RT-qPCR检测FTO在T-ALL细胞与正常对照细胞中的表达;在T-ALL细胞中沉默和过表达FTO,并检测细胞的m6A修饰水平、生长和集落生成等;检测沉默FTO对细胞凋亡及Jurkat细胞在免疫缺陷（NSG）小鼠中诱发白血病的能力;检测沉默FTO对T-ALL患者来源细胞和正常造血细胞增殖的影响。（2）RNA-seq筛选T-ALL细胞中受FTO表达影响的差异表达基因,并使用RT-qPCR验证;通过放线菌素D（ActD）和RNA甲基化免疫共沉淀（methylated RNA immunoprecipitation,MeRIP）等实验筛选FTO的下游靶基因;在单独沉默RAB7A（RAS-related GTP-binding proteins）后,检测细胞生长、集落生成和细胞凋亡等;在沉默FTO细胞中过表达RAB7A,通过RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecitation,RIP）研究 YTHDF2（YTH domain family 2,m6A 识别蛋白）与 RAB7A mRNA 之间的相互作用;使用精胺普鲁兰递送的方法,在沉默FTO的细胞中沉默YTHDF2,检测细胞的生长、集落生成和RAB7A表达等。（3）检测FTO的抑制剂（FB23-2）对T-ALL细胞的活性、集落生成、细胞凋亡和白血病生成能力的影响;并检测FB23-2对T-ALL患者来源细胞和正常造血细胞增殖的影响。结果:（1）FTO在T-ALL细胞较正常造血细胞中异常高表达;FTO调控T-ALL细胞的m6A修饰水平,FTO促进T-ALL细胞的体外生长及集落生成能力;沉默FTO促进细胞凋亡、显著减弱Jurkat细胞在NSG小鼠中的成白血病能力（2）RNA-seq和验证显示FTO在转录后水平调控RAB7A的表达,沉默FTO增强RAB7A mRNA上的m6A修饰;沉默RAB7A显著抑制T-ALL细胞的生长和集落生成能力,并诱发细胞凋亡;过表达RAB7A能部分“挽救”沉默FTO导致的生长抑制和凋亡增高;YTHDF2能在沉默FTO细胞中较对照细胞更强地结合RAB7A mRNA,沉默YTHDF2部分“挽救”沉默FTO导致的生长抑制与RAB7A表达受抑。（3）FB23-2有效抑制T-ALL细胞的活性,集落生成能力,并诱发凋亡,但对正常造血细胞影响较小;FB23-2也显著减弱Jurkat细胞的白血病生成能力。结论:FTO在T-ALL细胞中异常高表达,通过抑制RAB7A的m6A/YTHDF2依赖性降解而稳定其表达;FTO/m6A/RAB7A通路促进T-ALL细胞的生长与生存;FTO的小分子抑制剂具有一定的抗T-ALL效能。
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