LncRNA3901通过SUMO1/DAXX促进缺氧复氧诱导内皮细胞凋亡的机制研究

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【目的】
  1.建立内皮细胞缺氧复氧(HR)模型,验证课题组前期实验结果:lncRNA3901在HR诱导HUVEC细胞凋亡中表达上调;lncRNA3901表达上调促进DAXX细胞质转移,激活Fas/DAXX/ASK1/JNK通路诱导细胞凋亡。
  2.探讨lncRNA3901对SUMO1/DAXX信号通路的调控作用,进一步阐明lncRNA3901调控缺氧复氧诱导内皮细胞凋亡的分子机制。
  【方法】
  实验用人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)建立缺氧复氧模型,模拟体内缺血再灌注损伤,将正常培养的HUVEC培养至80%的密度时,换用无糖和无血清的培养基后放置于密封的缺氧小室(Chamber)中,充入低氧三元气体(94%N2、5%CO2、1%O2),并将缺氧小室放入37℃恒温箱培养12h,然后将培养基换为完全培养基,继续正常培养8h。(1)首先验证HR诱导内皮细胞凋亡,并激活Fas/DAXX相关信号通路。流式细胞术检测细胞凋亡率;免疫荧光实验和WesternBlot检测DAXX核质分布水平;WesternBlot检测DAXX、Fas通路以及凋亡相关蛋白的表达水平。(2)RT-PCR验证HR模型中lncRNA3901的表达水平;敲低、过表达lncRNA3901,检测lncRNA3901差异表达对DAXX胞内分布的调控,以及对HR诱导细胞凋亡的影响。(3)利用FISH实验分析lncRNA3901亚细胞定位;通过RNAPull-down实验、生物质谱和RNA免疫沉淀(RIP)技术筛选并验证lncRNA3901与SUMO1蛋白相结合。(4)利用CO-IP实验验证HR诱导DAXX蛋白SUMO化水平的变化;敲低SUMO1,观察DAXX蛋白SUMO化水平改变与DAXX核质分布改变的关系,以及敲低SUMO1对HR诱导细胞凋亡的影响。(5)敲低、过表达lncRNA3901,利用CO-IP检测lncRNA3901表达差异对DAXXSUMO化水平的影响;将SUMO1表达质粒共转染至lncRNA3901过表达细胞系,观察SUMO1表达上调对lncRNA3901过表达诱导的细胞凋亡的影响。
  【结果】
  1.HR激活DAXX/ASK1通路诱导内皮细胞凋亡。流式结果显示,HR可以诱导内皮细胞调亡,使用JNK抑制剂SP600125预处理能减少HR诱导的细胞凋亡;免疫荧光实验和核质分离WesternBlot结果显示,NC组细胞中DAXX主要在细胞核内分布,HR处理能显著诱导DAXX转移至细胞质中。WesternBlot结果显示,HR组细胞的BAX、cleaved-caspase3等凋亡相关蛋白表达增加,同时HR组Fas、p-ASK1、p-JNK等Fas通路蛋白水平明显上调。
  2.lncRNA3901在HR处理的内皮细胞中表达上调。敲低lncRNA3901可抑制DAXX细胞质分布、抑制Fas通路激活,同时减少HR诱导的细胞凋亡;过表达lncRNA3901能促进HR诱导的DAXX细胞质分布和内皮细胞凋亡。
  3.FISH实验表明lncRNA3901在细胞质中丰富表达,RNAPull-down实验联合蛋白质谱分析筛选,以及RIP实验反向证实lncRNA3901与SUMO1蛋白相结合。进一步行deletedmapping实验发现,lncRNA3901的5’端1-250碱基序列是与SUMO1特异性结合的必须片段。
  4.SUMO1调节DAXXSUMO化修饰水平:在HR诱导内皮细胞凋亡模型中,SUMO1结合蛋白的表达水平显著降低;同时CO-IP实验证实HR可以抑制DAXXSUMO化修饰。敲低SUMO1能增加HR诱导的DAXX细胞质转移,从而促进HR诱导细胞凋亡。
  5.lncRNA3901调控DAXX的SUMO化水平:根据CO-IP和WesternBlot结果,敲低lncRNA3901时,HR对DAXXSUMO化抑制作用减少,细胞质中DAXX表达水平下降;过表达lncRNA则进一步增加HR对DAXXSUMO化抑制作用,细胞质中DAXX表达增多。而在细胞功能回复实验中,共转染过表达SUMO1可逆转过表达lncRNA3901后HR诱导的内皮细胞凋亡。
  【结论】
  lncRNA3901通过结合SUMO1,抑制SUMO1介导的DAXX蛋白SUMO化修饰,从而促进DAXX细胞质转移,进而促进HR诱导的内皮细胞凋亡。
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