【研究背景】高血压是一种以体循环动脉压升高为主要特点,由基因遗传、环境及多种危险因素相互作用所导致的全身性疾病,它是最常见的慢性病,也是心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)最主要的危险因素,作为冠心病、心力衰竭、脑卒中及慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)的主要并发症,不但致残、致死率高,且严重消耗医疗和社会资源,给家庭和社会造成沉重负担。高血压性心脏病是指长期血压控制不佳而引起的左心室肥厚和左心室舒张功能减退,进而进展为心力衰竭的疾病。高血压性左心室肥厚(Hypertensive left ventricular hypertrophy,HTN-LVH)是高血压性心脏病的特征性表现之一。左心室肥厚的发生、发展常引起心脏传导系统障碍,甚至引起猝死。因此,及早发现、及时诊断治疗在高血压性心脏病患者的预后中显得十分重要[1]。临床上一般使用心脏超声作为其首要诊断措施,虽然它能基本满足人们的诊疗需求,但在正确率和检出率的限制性上仍然促使人们去探索更精确的诊疗方法。近年来,研究者发现血液中微小RNA对其诊断有重要参考价值,微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内源性的非编码单链小RNA,它包含20-25个核苷酸序列,具有时间、空间特异性和器官特异性,通一系列核酸酶剪切与加工而产生,随后组装进RNA诱导的沉默复合体,通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA,并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。有大量动物和实验研究文献报道,miRNA的调控在血液系统、消化系统、肿瘤等众多领域的研究取得了突破性进展,同样,在心脏发育、心律失常以及心肌肥厚等病理和生理过程中同样发挥着重要的作用。例如,Fish等研究发现miRNA-166表达不仅与血管发育的过程有关,而且与血管完整性的保持和血管生成息息相关。Schneider等研究指出在胚胎时期的心肌细胞中miR-1分子特异性表达,而心脏瓣膜和血管的形成则与miR-199有关。Thum等实验结果示,mir-21通过抑制SH1基因激活ERK-MAP信号通路导致生长因子的分泌和成纤维细胞的活化,扩大心脏纤维化。同样在心肌肥厚方面,有报道指出miRNA-27b可通过作用于靶分子MMP13(金属基质蛋白酶13)使心肌肥厚,同时上调心脏组织中胶原分子COLI和COLIII表达。有也研究发现miR-27b能直接靶向作用于过氧化物酶体增殖物激活受体--γ(PPARγ)抑制其表达,导致心肌肥大和心功能障碍等。虽然对于具体促进心肌肥大机制并没有达到共识,但在细胞实验中发现,人为加入miR-27b共培养的心肌细胞明显比没有加入miR-27b培养的心肌细胞肥大。在探索miRNA与心肌肥厚关系的同时,人们对miRNA的运载方式研究也日益深入。大量报道指出,miRNA的转运是以一种特殊的方式进行---外泌体(exosome)。exosome是由细胞分泌的具有脂质双分子层膜结构的直径约30-100nm的微囊泡,几乎所有的细胞都能分泌外泌体,其内部携带着不同状态下细胞产生的蛋白质、mRNA、miRNA和长链非编码RNA(lncRM)等物质。研究表明,它们可以介导一定距离细胞间物质交换。这一交换是以细胞内遗传物质mRNA或miRNA(信使RNA或微小RNA)被包裹入外泌体并向细胞外环境中释放为基础的[2]。外泌体的脂质双分子层结构可以保护其内容物不被循环中的蛋白酶以及核酸酶降解[3],比血浆中存在的miRNA更稳定。近年来,研究者们对外泌体的分泌和转导机制进行了深入探索,以求阻断其致使心肌肥厚的途径[2-4]。基于以上发现,本课题组推测外泌体中的miR-27b表达量的升高可能提示存在高血压左心室肥厚的风险。本实验在动物实验的基础上,收集人类血液标本,去探索高血压患者中外泌体中miR-27b与心肌肥厚之间的关系。【研究目的】探讨外泌体中miR-27b在高血压患者中表达水平以及对诊断HTN-LVH的参考价值。【研究方法】1.收集标本本研究严格按照纳入标准和剔除标准,收集2015年4月至2017年1月期间就诊于广州医科大学附属第二医院内科住院部的患者,一共收集到94例符合本研究的患者,将其分为HTN-LVH组(n=38)和高血压无肥厚的对照组(n=56)两组。入院后收集所有患者的年龄、性别、体重、吸烟、饮酒、收缩压、舒张压、空腹血糖、糖化血红蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、总甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、血肌酐、乳酸脱氢酶、B型脑钠肽、左室内径、右室内径、左心室后壁厚度、室间隔厚度和左室射血分数。并于次日清晨空腹抽取患者的静脉血,用装有枸橼酸钠抗凝剂的试管装载。2.保存和提取于采集到病人血液后2小时内离心,去掉红细胞、血小板和一些大碎片物质,将离心后的血浆置于-80℃冰箱冻存,待最后一起解冻。将每个样品分成两组,一组为200ul血浆检测其中总miRNAs,另一组取2000ul后提取外泌体,再测其miRNAs。3.逆转录和qRT-PCR将全部样本一起逆转录,采用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(Quantificational reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)分别检测每个样本中miR-27b的相对表达量。4.统计学分析运用SPSS 17.0统计软件对所有统计数据进行统计学分析,分别进行方差齐性和正态性检验,符合方差齐性和正态齐性分布的计量资料可用均数±标准差表示结果,对于不符合者则可运用中位数表示。HTN-LVH组和高血压无肥厚组间miR-27b相对表达量差异比较可以运用t检验统计,外泌体所占血浆的比值在两者间的区别同样运用t检验进行分析。使用Pearson相关分析法探究外泌体中miRNA-27b与室壁厚度的关系。使用受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve,ROC曲线)评估外泌体中miR-27b对心肌肥厚的诊断价值。所有分析检验方法中统计学结果均以P<0.05为差异具有意义。【结果】1.高血压性左心室肥厚组血浆和外泌体中miR-27b的相对表达量较对照组显著增高(P<0.05)。2.在HTN-LVH组,外泌体中miR-27b表达水平与IVSd和LVPWd呈正相关(P<0.05),相关系数(r)分别为0.55和0.60。3.外泌体中miRNA-27b表达量曲线下面积(AUC)为0.96,敏感度为86.7%,特异度为96.7%;血浆中AUC则为0.86,敏感度为73.3%,特异度80%。【结论】1.血浆及外泌体中miR-27b的相对表达量与高血压性左心室肥厚成正相关,血浆或外泌体中miR-27b升高提示存在高血压性左心室肥厚的风险。2.外泌体中miR-27b比血浆中的灵敏度和特异度更高。