[目 的]前期研究发现p62蛋白在骨巨细胞瘤组织中高表达,下调p62蛋白表达能够抑制骨巨细胞瘤单核基质细胞增殖及侵袭。本研究将探讨该蛋白的调控机制,是否通过RANKL-RANK-NF-κb通路,明确p62蛋白是通过经典还是非经典途径激活NF-κb信号,是否依赖自噬反应。[方 法]1.留取骨巨细胞瘤新鲜组织,进行细胞分离及原代培养,采用免疫荧光检测RANKL蛋白、组蛋白H3.3 G34W,明确分离的细胞为单核基质细胞,进行细胞传代,利用细胞衰老实验,选取增殖活跃的细胞进行后续实验。2.采用地舒单抗处理单核基质细胞,阻断RNAKL信号,通过CCK8、流式细胞仪检测细胞增殖能力改变,通过细胞侵袭及迁移实验观察单核基质细胞侵袭能力改变;同时,采用Western Blot、免疫荧光检测下游信号p62蛋白表达、NF-κb激活的变化。3.采用慢病毒质粒转染上调或下调P62基因表达,通过Western Blot、免疫荧光检测,观察p62蛋白表达水平对NF-κb信号关键激酶IκBα活性影响,观察NF-κb信号主要亚基P65、P52入核变化,观察细胞自噬LC3B Ⅱ/Ⅰ蛋白表达变化。[结 果]1.分离出主要由单核基质细胞和破骨样多核巨细胞两种细胞组成的骨巨细胞瘤原代细胞,破骨样细胞在传代48小时后开始减少,至2-3代基本消失,对剩余的细胞检测发现,RANKL蛋白定位于细胞浆、组蛋白H3.3 G34W定位于细胞核,两个标志蛋白均特异性表达于剩余细胞中,证实分离的细胞为单核基质细胞;对不同传代的单核基质细胞,进行β-半乳糖苷酶染色发现第四代细胞生长活跃,并且衰老细胞比例最低,采用第四代单核基质细胞进行后续实验。2.地舒单抗阻断RNAKL最佳浓度为800μg/ml,使用该浓度处理单核基质细胞,地舒单抗处理组24h、48h、72h、96h细胞增殖相对OD值的均值分别为:0.568±0.023、0.595±0.012、0.706±0.022、0.921±0.049,对照组 24h、48h、72h、96h 细胞增殖相对 OD 值的均值分别为:1.404±0.040、1.758±0.064、1.889±0.613、2.584±0.098,两组间有统计学差异(P<0.05);地舒单抗处理组单核基质细胞细胞细胞凋亡百分比为23.615%,对照组细胞凋亡百分比为2.836%,两组间有统计学差异(P<0.05);地舒单抗处理组与对照组相比,单核基质细胞侵袭及迁移能力均明显下降,两组间均有统计学差异(P<0.001)。地舒单抗处理组和对照组相比,Western Blot及免疫荧光检测发现RANKL蛋白、p62蛋白、组蛋白H3.3 G34W的表达量均有不同程度下降,两组间均具有统计学差异(P<0.05);Western Blot检测发现NF-κb相关亚基P65、P52蛋白表达减少,两组间有统计学差异(P<0.05)。3.Western Blot结果显示shP62下调组较NC对照组NF-κb信号关键激酶IκBα磷酸化水平降低,两组间有统计学差异(P<0.05)。免疫荧光结果显示shP62下调组较NC对照组主要亚基P65、P52蛋白表达水平显著降低,两组间均具有统计学差异(P<0.05)。Western Blot检测发现shP62下调组较NC对照组LC3BⅡ/Ⅰ无明显变化,差异不具有统计学意义(ns)。免疫荧光结果显示p62蛋白表达与自噬LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达无明显相关性。[结论]1.p62蛋白可通过RANKL-R ANK-NF-κb信号调控单核基质细胞增殖及侵袭;2.p62蛋白可通过经典及非经典途径激活NF-κb信号,并且不依赖自噬反应调节。