薄荷精油及其主要成分L-薄荷醇抑制酸腐菌机理研究

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酸腐菌(Geotrichum citri-aurantii),是侵染果蔬作物的一类致病菌,主要侵染葡萄、柑橘等水分含量大的作物引起果蔬酸腐病,可导致果实表皮腐烂,生成白色菌落,产生水渍状伤口。具备染病能力强、传播范围广等特性,严重影响果蔬采后品质与其商业价值。本文利用薄荷精油中主要效用成分L-薄荷醇抑制酸腐菌生长,进一步深入探究L-薄荷醇对酸腐菌的分子作用机理,该研究结果为探索真菌抑制机理提供新见解,为薄荷精油在食品安全领域的开发应用提供理论依据。取得的主要研究结果如下:1.通过体外平板抑菌实验探究不同浓度薄荷精油对酸腐菌的抑制效果,实验结果表明,薄荷精油可以抑制酸腐菌菌丝生长和孢子萌发,抑制效果与精油浓度之间呈正比例关系,2.0 μL/mL薄荷精油添加量对酸腐菌的抑制率达到100%。通过葡萄果实体内侵染实验探究薄荷精油对葡萄果实酸腐菌致病效力影响,结果表明薄荷精油能有效保护葡萄果实防止酸腐病发生,同时物性评价说明薄荷精油能够显著增强果实的硬度。为了解薄荷精油中作用成分,采用GC-MS分析获得薄荷精油成分表,筛选得到四种高占比且具有潜在抑菌效力的化合物,分别为L-薄荷醇、石竹烯、桉树脑及正己烷。2.薄荷精油四种成分对酸腐菌体外平板抑制实验结果表明,四种化合物对酸腐菌菌丝生长和孢子萌发的抑制效果从强到弱依次为:L-薄荷醇>石竹烯>桉树脑>正己烷,同时,L-薄荷醇对酸腐菌菌丝生长和孢子萌发的抑制效果强于薄荷精油。体外抑菌实验结果表明,薄荷精油和L-薄荷醇处理后可以破坏细胞膜,导致孢子内外糖含量发生变化,细胞膜结构蛋白碱性磷酸酶AKP含量发生变化,扫描电镜显示L-薄荷醇处理后孢子膜结构破碎,表面析出颗粒物质,同时孢子整体形态变胶着不易分散。3.进一步对薄荷精油及L-薄荷醇的抑菌机理进行研究。PI荧光探针法测定发现L-薄荷醇可以破坏孢子膜,同时膜电导率明显升高。ROS探针测得孢子内活性氧含量激增,同时抗氧化酶CAT、POD、SOD的酶活发生剧烈变化,合成这些酶的基因表达量改变。AO染色发现孢子内部遗传物质发生不同程度降解。SPLOM模型筛选L-薄荷醇处理引发的关联性,结果表明孢子膜通透性的变化可能继发性导致孢子膜蛋白质,活性氧水平以及遗传物质降解,而孢子膜蛋白质可能诱导POD酶活性变化。4.转录组测序结果显示,酸腐菌经L-薄荷醇处理后与未处理组间基因表达情况不同,共筛选得到1704差异基因。GO功能分析显示差异基因注释到2125个功能类,主要涉及的生物过程有跨膜转运,小分子生物合成过程等1436个过程;细胞构成主要富集在细胞质膜,菌丝细胞壁等182个部位;分子功能主要富集在碳水化合物跨膜转运蛋白活性,磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性等507个功能。KEGG结果显示差异基因主要分布在生物信息过程(70 DEGs)和代谢(356 DEGs)两个一级通路,主要二级通路为MAPK信号通路,酪氨酸代谢,丙酮酸代谢。差异基因相互作用网络图中,相关度大于0.95的基因有77个,其中节点最多的10个枢纽基因分别是 CIT1、CDC 21、RAD 27、TOP2、MLS 1、YDJ 1、CYB 2、RNR2、POL 30、SMC 3,这些基因在子网络中分别富集于代谢途径、乙醛酸和二羧酸的代谢、丙酮酸代谢。对枢纽基因中SCM 3、POL30、CDC 21、RNR2、RAD 27、TOP2基因进行荧光定量分析,发现POL 30基因变化最明显,分子对接模拟得到L-薄荷醇和POL 30在第44位ARG残基处通过氢键相结合,键能3.67K,作用距离3.2 nm。流式细胞仪测定后得出L-薄荷醇处理使酸腐菌细胞周期停滞在S期,并且导致细胞发生部分凋亡。
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