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核酸(DNA)大分子是人体生命最基本物质之一,而具有反应活性的内源性小分子或药物分子可与DNA中的碱基发生共价加合反应,这些反应可能改变核酸在细胞内的一系列生理过程,导致遗传信息的错误传递,蛋白质的不完全合成,细胞死亡等。因此,从分子层面定性及定量地研究这些小分子与DNA的加合物可帮助人们更好的理解生物体内DNA结构的改变情况,及这些小分子可能导致的致癌或治癌机理。乙二醛和甲基乙二醛可在体内自发产生,并与鸟嘌呤、腺嘌呤等核苷碱基反应生成复杂产物,目前对这些产物的结构、绝对构型及稳定性研究仍缺乏深入报道;补骨脂素作为治疗牛皮癣等疾病的药物分子,它在长紫外光(UVA)照射下除可产生致细胞死亡的DNA链间交联产物(ICL)外,还可产生种类各异的DNA单加合物(MA),本文期望应用灵敏的分析方法高效定量测定这些加合产物在人体细胞中生成的效率。
首先,本文制备并成功分离了乙二醛(g)、甲基乙二醛(mg)与鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)加合生成的单加合产物(G-g,G-mg,A-g,A-mg)与双加合产物(G-2mg,A-2mg),且利用高效液相色谱一多级质谱(LC-MSn)联合圆二色光谱的方法确定了这些加合物均为数对非对映异构体。随后,本文应用核磁共振方法确定了G-g和G-mg的结构(见下图),通过分子模拟计算及“八域规则”方法联用推断了鸟嘌呤单加合物非对映异构体的绝对构型。根据保留时间的不同,G-g两个非对映异构体和G-mg中具有反式邻羟基结构的两个异构体构型分别为(6R,7R)和(6S,7S)。研究结果发现中性溶液中G-g比G-mg稳定,而顺式G-mg构型比反式要稳定,且不同构型的G-mg存在不同的外消旋反应途径。此外,通过LC-MSn可判定A-g和A-mg在溶液中的结构(见下图),并通过类比物及圆二色光谱结果推测了这两对腺嘌呤加合物非对映异构体的绝对构型,其中,保留时间较短的异构体均为(2R)构型,而保留时问较长的均为(2S)构型。G-2mg与A-2mg结构在多级质谱碎裂中存在特征性碎裂模式,本文应用16O/18O同位素交换标记的方法系统研究了这两个化合物在质谱正离子和负离子模式下的碎裂途径,并提出了可能的碎裂离子结构。结合双加合物的核磁分析,18O标记及多级质谱碎裂结果,文中提出双加合物在溶液中存在两种平衡结构,既三环两性离子结构与开环支链结构并存。
除应用质谱定性分析DNA加合物外,本文还进行了质谱在DNA加合物定量分析的推广。通过运用发展的LC-MS/MS、同位素稀释、单一核酸酶P1联用方法,本工作对比了两种补骨脂素衍生物(8-MOP与S59)在人体黑素瘤细胞中产生ICL的效率,并首次将该方法推广至定量分析补骨脂素在细胞中产生MA的情况。分析结果表明,在UVA照射下,新研制的S59比8-MOP更能有效地在细胞中导致ICL和MA的生成,且ICL的产量均随照射剂量的增加而增高;同时,该方法可在细胞中检出三种8-MOP-MA及五种S59-MA产物,并系统分析了每种产物在不同UVA照射剂量下的形成产量。