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目的:肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌,被列为全球第六大最常见的肿瘤和第三大癌症相关死因的疾病。手术切除是治疗原发性或转移性肝癌的首选方法。但是,由于病灶解剖位置限制,病灶多发,肝功能储备不足,肝外转移或其他合并症,很多患者并不适合进行肝切除手术治疗。而最常用的替代性治疗为肿瘤的射频消融治疗（RFA）。射频消融治疗在通过加热使肿瘤产生原位凝固性坏死的同时,还可以释放肿瘤相关抗原,诱导机体对肿瘤产生特异性免疫反应,增强机体的抗肿瘤作用,对远处转移和复发的肿瘤有一定的抑制作用。然而RFA诱导的肿瘤特异性T细胞激活的时间有限,射频消融激活的抗肿瘤免疫反应仅可以短暂抑制远处肿瘤的生长,很快肿瘤又恢复原来的生长速度,甚至生长速度加快,不足以预防肿瘤的复发和转移。目前对RFA后远处肿瘤的免疫状态的评价和免疫减弱的机制研究较少。本课题利用超声造影（CEUS）对RFA治疗后远处肿瘤的不同免疫状态进行评价,并探索远处肿瘤内RFA诱导的抗肿瘤免疫减弱的发生机制,为RFA联其他治疗提供更好的时机和更多的药物选择靶点。研究方法:1.根据RFA后右侧腋下肿瘤生长曲线确定研究时间点:将24只双侧腋下皮下H22肝细胞癌种植瘤小鼠模型随机分为两组（每组12只）。实验组（RFA组）消融左侧腋下肿瘤而保留右侧肿瘤,对照组（Non-RFA组）不进行治疗,各组均将右侧肿瘤作为观察对象。RFA后每天应用超声测量两组小鼠右侧的肿瘤大小,并绘制肿瘤体积的生长曲线。根据肿瘤生长曲线,分别选择RFA组右侧未消融肿瘤停止生长和恢复快速生长的两个时间点进行研究。2.超声造影评价射频消融后远处肿瘤的免疫状态:第二批24只小鼠模型,分别于上述实验确定的两个时间点对两组小鼠的右侧肿瘤进行CEUS检查和病理组织学分析。通过CEUS的时间-强度曲线（TIC）分析各造影增强参数的变化;CD8免疫组化染色分析肿瘤内CD8+T细胞的数量,来评价RFA后肿瘤内的免疫状态;TUNEL染色分析肿瘤内细胞凋亡情况;CD31免疫组化染色分析肿瘤内微血管密度;CD31+PAS双重染色分析血管生成拟态（VM）变化。并分别评价CEUS各个参数与VM数量的相关性关系。3.RFA后IL-6/STAT3/PD-L1通路抑制远处肿瘤免疫状态:实验对象为第三批24只小鼠模型的右侧肿瘤组织和预先用IL-6和BP-1-102（p-STAT3抑制剂）刺激的细胞,CD8免疫组化染色分析肿瘤内CD8+T细胞的数量,来评价RFA后肿瘤内的免疫状态;PD-L1免疫组化染色分析肿瘤内PD-L1的蛋白表达情况;TUNEL染色分析肿瘤内细胞凋亡情况;ELISA分析各组小鼠血清IL-6的变化;实时荧光定量PCR分别分析肿瘤组织和各细胞处理组PD-L1的m RNA的转录水平;Western blot分析各组肿瘤组织和各细胞处理组的PD-L1、p-STAT3蛋白表达水平的变化,从而验证RFA/IL-6/STAT3信号通路调节PD-L1作用。CKK-8检测体外四组细胞的增殖能力。结果:1.与对照组相比,RFA治疗后第3天实验组小鼠右侧肿瘤生长轻度减缓（P=0.038）,经过短暂抑制后,第6天恢复与对照组组相同的生长速度（P=0.665）,根据肿瘤生长曲线,分别选择消融后第3天和第6天两个时间点来进一步研究。2.CD8+T细胞:在对照组,第3天和第6天肿瘤内浸润的CD8+T细胞数量没有差异;然而在实验组,第3天肿瘤内CD8+T细胞较对照组明显增加,第6天肿瘤内CD8+T细胞数量的浸润与对照组没有明显差异;实验组内第3天肿瘤内CD8+T细胞明显高于第6天（P<0.001）。CEUS:CEUS所有肿瘤超声造影模式均表现为“快进”和“慢出”。TIC参数分析显示,第3天,实验组肿瘤内的血流灌注减少,表现为PI,TTP,AWI和AWO下降,而第6天,实验组肿瘤内的血流灌注增加,表现为PI,TTP,AWI和AWO升高,二组之间各参数差异有统计学意义（P值分别为:<0.001,0.017,0.005,0.002）;与对照组相比,第3天实验组TIC参数轻度降低,第6天轻度升高,二者比较无统计学差异。TUNEL:第3天,RFA组远处肿瘤内细胞的凋亡率高于对照组;第6天,实验组肿瘤细胞凋亡率与对照组相比无显著差异;实验组第3天的肿瘤细胞凋亡率显著高于第6天（P<0.001）。MVD:各组之间比较无统计学差异。VMD:在对照组,第3天和第6天VMD没有显著差异;实验组,第3天肿瘤内VMD较对照组轻度降低,第6天肿瘤内VMD比对照组轻度升高,均没有统计学差异（P=0.995）;实验组内第6天肿瘤内VMD明显高于第3天（P=0.003）。超声造影的TIC参数与VM的相关性:肿瘤超声造影的TIC参数（PI,TTP,AWI和AWO）与VMD之间呈正相关,具有统计学差异（PI:r=0.75,P<0.001;TTP:r=0.56,P=0.005;AWI:r=0.77,P<0.001;和AWO:r=0.48,P<0.001）。3.PD-L1:对照组,第3天和第6天PD-L1没有显著差异;实验组,第3天肿瘤内PD-L1较对照组轻度降低,第6天肿瘤内PD-L1比对照组轻度升高,均无统计学差异;而实验组内第6天肿瘤内PD-L1明显高于第3天（P<0.05）。PCR检测第6天实验组右侧肿瘤内PD-L1的m RNA增加;Western blot检测第6天实验组右侧肿瘤内PD-L1,p-STAT3蛋白表达增加;PCR检测经IL-6刺激的H22细胞PDL1的m RNA升高;Western blot检测IL-6+H22细胞PD-L1蛋白表达增加明显高于阴性对照H22组,H22+BP-1-102组和H22+IL-6+BP-1-102组。CCK-8检测IL-6+H22细胞组增殖能力明显高于H22组,H22+BP-1-102组和H22+IL-6+BP-1-102组。结论:1.RFA可以诱导肿瘤特异性免疫,远处肝细胞癌的生长情况与肿瘤内浸润T细胞相关。2.免疫反应可以导致远处肝细胞癌的肿瘤细胞凋亡,也可以导致由肿瘤细胞形成的VM数量减少,因此VM的数量可间接反映RFA后远处肝细胞癌的免疫状态。CEUS可以无创性评价肿瘤内VM。这些结果表明CEUS与RFA后远处肿瘤的免疫状态相关,有可能成为监测RFA治疗后远处肝细胞癌的免疫反应的影像学方法。3.远处肝细胞癌的PD-L1增加可以抑制RFA激活的肿瘤特异性免疫反应,并发现RFA可以通过IL-6/STAT3/PD-L1信号通路来抑制消融后肿瘤特异性免疫反应。