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研究背景:绝经后骨质疏松症(Postmenopausal osteoporosis,PMOP)是因雌激素缺乏,而引起以骨量减少、骨微结构退化和易于骨折为特征的多因素骨病。雌激素替代疗法是目前临床上防治PMOP最常用的方法之一,但是因为长期使用外源性雌激素副作用较大,所以使用天然植物雌激素是改善及防治PMOP较好的替代方法之一。研究目的:本研究目的在于研究金丝桃苷对去势小鼠骨微结构和骨代谢的影响,以及金丝桃苷对破骨细胞分化的影响,并阐明其对破骨细胞形成的调控作用及分子机制。研究方法:1、以8周C57BL/6J雌性小鼠为实验对象,建立去势小鼠模型(OVX),以小鼠体内雌激素水平为指标,判定模型是否成功。给予不同浓度的金丝桃苷,观察金丝桃苷对去势小鼠骨量和骨微结构的影响。实验组分为假手术组、OVX模型组、OVX+结合雌激素组、OVX+金丝桃苷20 mg/kg组、OVX+金丝桃苷40 mg/kg组、OVX+金丝桃苷80 mg/kg组。每组8只,灌胃10周后,收集样本。采用双能X射线、Micro-CT和HE染色观察小鼠股骨的骨密度和骨微结构;利用ELISA试剂盒检测破骨细胞相关因子TRACP-5b、sRANKL、CTX-1的表达;对小鼠股骨切片进行TRAP染色,观察金丝桃苷干预后破骨细胞的变化;Western Blot观察各组骨吸收相关蛋白TRAP、RANKL、ITGβ3、c-Fos表达的变化。2、从小鼠的股骨和胫骨骨髓提取单核细胞,首先利用CCK-8法评价100μmol/L、10μmol/L和1μmol/L金丝桃苷对破骨前体细胞活力的影响;然后利用含25 ng/m L MCSF和50 ng/m L RANKL细胞因子的完全培养基诱导原代单个核细胞向破骨细胞分化,再采用TRAP染色、肌动蛋白环染色及抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)检测等方法评价100μmol/L、10μmol/L和1μmol/L金丝桃苷对破骨细胞形成及活性的影响。最后,运用Western Blot法观察各组破骨细胞相关蛋白TRAP、RANKL、ITGβ3、c-Fos表达的变化。3、复苏培养Hela细胞至密度达到约80%,通过质粒提取和细胞转染,检测双荧光素酶荧光强度。采用雌激素受体α拮抗剂MPP和雌激素受体β拮抗剂PHTPP研究100μmol/L金丝桃苷对破骨细胞活性的影响。采用ELISA试剂盒检测小鼠血浆中雌激素水平。同时运用Western Blot观察小鼠骨组织和破骨细胞中雌激素受体α的蛋白表达。研究结果:1、金丝桃苷抑制C57BL/6J去势小鼠骨丢失作用研究。去势10天后,与对照组相比,模型小鼠体内雌激素水平显著降低,表明去势骨质疏松小鼠模型建立成功。连续给药10周后,金丝桃苷对去势小鼠的子宫、心、肝、脾、肺和肾脏器指数无显著影响。与模型组相比,80mg/kg金丝桃苷组显著降低去势小鼠体重和脂肪含量,升高瘦肉含量(P<0.01)。在双能X射线、Micro-CT和股骨的HE染色中,与对照组相比,模型组小鼠的骨密度、骨矿物质含量、骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度明显下降(P<0.01);与模型组相比,结合雌激素组和80 mg/kg金丝桃苷组能明显提高骨密度,增加骨矿物质含量,升高骨小梁数量,增加骨小梁厚度,缩小骨小梁间隙(P<0.05)。股骨的TRAP染色结果显示,模型组小鼠股骨干骺端破骨细胞数量较对照组明显增多;与模型组相比,结合雌激素组、20 mg/kg、40 mg/kg和80 mg/kg金丝桃苷组减少股骨干骺端破骨细胞数量。ELISA结果显示,与对照组相比,模型组小鼠血浆中破骨细胞特异性指标TRACP-5b、CTX-1和sRANKL水平显著升高(P<0.01);与模型组相比,结合雌激素组、20 mg/kg、40 mg/kg和80 mg/kg金丝桃苷组明显降低去势小鼠血浆中TRACP-5b、CTX-1和sRANKL水平(P<0.01)。同时与模型组相比,结合雌激素组和80 mg/kg金丝桃苷组去势小鼠尿液钙磷和血浆中磷的含量显著减少(P<0.05),而对去势小鼠血浆中钙含量无显著影响(P>0.05)。Western Blot结果显示,与模型组相比,结合雌激素组和80 mg/kg金丝桃苷组能降低骨吸收相关蛋白TRAP、RANKL、ITGβ3、c-Fos的表达水平(P<0.05)。2、金丝桃苷抑制小鼠骨髓来源的单核细胞向破骨细胞分化。CCK8结果显示,100μmol/L、10μmol/L和1μmol/L金丝桃苷对破骨前体细胞活性无影响(P>0.05)。与空白组相比,模型组TRAP酶活性和破骨细胞面积显著升高(P<0.01),形成明显的肌动蛋白环;与模型组相比,100μmol/L和10μmol/L金丝桃苷明显减少TRAP阳性细胞数量和显著降低TRAP酶活性(P<0.05),抑制破骨细胞肌动蛋白环的形成(P<0.05)。Western Blot结果显示,与模型组相比,金丝桃苷能明显降低破骨细胞分化相关TRAP、RANKL、ITGβ3、c-Fos蛋白的表达水平(P<0.05)。3、基于雌激素受体α的金丝桃苷抑制破骨细胞分化的分子机制研究。ELISA结果显示,与模型组相比,结合雌激素组、40 mg/kg和80 mg/kg金丝桃苷组小鼠体内雌激素水平显著升高(P<0.05),表明金丝桃苷具有雌激素样作用。雌激素受体筛选实验结果显示,不同浓度的金丝桃苷对雌激素α受体的亲和力强于雌激素β受体。综合采用雌激素α受体拮抗剂MPP和雌激素β受体拮抗剂PHTPP分别研究其对破骨细胞活性的影响,结果显示,与100μmol/L金丝桃苷组相比,金丝桃苷+MPP组TRAP酶活性显著升高(P<0.05),而金丝桃苷+PHTPP组,TRAP酶活性无显著变化(P>0.05)。Western Blot结果显示,与模型组相比,金丝桃苷能升高雌激素α受体的蛋白表达水平(P<0.05)。结论:1、金丝桃苷能显著抑制去势导致的小鼠骨丢失,明显改善去势小鼠骨微结构损伤,恢复小鼠体内破骨细胞标志物水平,显著降低骨吸收相关蛋白的表达。2、金丝桃苷显著抑制骨髓来源的单核细胞向破骨分化和肌动蛋白环的形成,减小破骨细胞的面积,降低破骨细胞相关蛋白的表达。3、金丝桃苷通过上调雌激素受体α表达,抑制破骨细胞的分化和骨吸收活性。