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【研究背景及目的】肝囊肿是一组病因不同的异质性疾病,其中包括散发的单纯性肝囊肿和遗传性多囊肝病(polycystic liver diseases,PLD)两种主要类型。虽然此病患者大多表现为良性病程,但也有部分患者出现与囊肿增大及随后腹部器官受压相关的症状和并发症,如腹痛、早饱、食管返流或囊内出血、感染,甚至囊肿破裂等,极少数患者会因为囊肿体积过大、数量过多造成肝功能受损,甚至肝衰竭。目前此病的主要方法包括保守治疗、抽吸硬化疗法、开窗手术、肝部分切除及肝移植等。其中,肝部分切除术和肝移植是目前疗效确切的两种方法,但肝部分切除术作为一种有创手术,术后并发症较多,而肝移植在临床实践中受到诸多限制。因此,肝囊肿需要其他创新且有效的治疗方式,探索肝囊肿形成的分子机制有助于寻找新的治疗靶点。作为肝囊肿的主要发病类型之一,PLD可以以孤立的常染色体显性遗传多囊性肝病(autosomal dominant polycystic liver disease,ADPLD)发生,或者合并多囊性肾病(polycystic kidney diseases,PKD)出现。研究表明,遗传性PLD伴常染色体显性多囊肾病(PKD)由PKD1或PKD2胚系突变导致,而ADPLD可能由PRKCSH、SEC63和LRP5等基因突变引起。与PLD相比,单纯性肝囊肿是散发的,其遗传背景目前尚不清楚。肝囊肿形成的病理生理学改变包括胆管板畸形(ductal plate malformation,DPM)及胆管上皮细胞异常增殖。胆管板畸形是指胆管发育过程中,胆管板重塑异常,具体可表现为胆管上皮细胞极性紊乱、初级纤毛装配及功能异常。SEC63是一个内质网相关基因,参与蛋白质的共翻译及转运过程,其缺失突变会导致ADPLD的发生与发展。并且,敲除人胆管上皮细胞中的SEC63会破坏初级纤毛的形成。可见,SEC63在肝囊肿的形成中扮演重要角色。然而,SEC63的转录调控尚未被阐明。性别决定区Y-框蛋白9(Sex-determining region Y-box protein 9,SOX9)在脑、肠、肺、肾、肝等多种组织类型和器官中表达,并控制多种细胞的分化。在肝脏中,SOX9主要表达于胆管上皮细胞,是最常用的胆管标志物之一。在肝内胆管发育过程中,SOX9决定了胆管形态发生的时机,调控了对称胆管结构的形成。有研究报道,SOX9控制胆管上皮细胞的分化、极性和纤毛的形成,并调节正常胆管发育所需的例如转化生长因子-β(TGF-β)、Notch和Hippo信号通路中信号分子的表达。以上结论表明SOX9在胆管发育和决定胆管上皮细胞命运中起到重要作用。课题组的前期工作证明了肝脏特异性敲除Sox9能够促进肝癌发生,在此过程中构建了肝脏特异性敲除Sox9的小鼠,意外观察到肝脏特异性敲除Sox9的小鼠在未经造模的情况下会自发形成肝囊肿,提示SOX9表达失调可能参与肝囊肿的形成。因此,基于以上研究背景及前期基础,本课题旨在进一步明确SOX9在肝囊肿形成过程中的作用,并深入探讨其分子机制。【实验方法】一、肝脏特异性敲除Sox9对小鼠肝囊肿形成的影响1.构建并鉴定Sox9LKO小鼠。将Sox9f/f小鼠与白蛋白驱动表达Cre重组酶的Alb-cre工具小鼠杂交,构建Sox9LKO(Sox9f/f:Alb-Cre+)小鼠。PCR及琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型后进行分组。分别留取Sox9f/f小鼠与Sox9LKO小鼠肝脏,利用Western blot、免疫组化和免疫荧光检测肝组织中SOX9蛋白的表达水平。2.观察肝脏特异性敲除Sox9对小鼠肝囊肿形成的影响。分别在不同月龄处死Sox9f/f小鼠与Sox9LKO小鼠,通过大体观察小鼠肝脏表面与micro-CT观察小鼠肝脏内部的肝囊肿发生情况,对肝囊肿数量、大小及发生率等进行统计。并且采用H&E染色、天狼星红染色、免疫组化等方法对两组小鼠的肝组织进行组织病理学分析。同时评估丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸转氨酶(AST)和总胆红素(TBIL)等小鼠血清肝功能指标。二、敲除/敲减SOX9对胆管上皮细胞增殖能力、极性及初级纤毛形成的影响1、在体外人肝内胆管上皮细胞中,通过小干扰RNA(siRNAs)敲减SOX9后,应用CCK-8试剂盒检测细胞活性,绘制生长曲线。2、在Sox9f/f小鼠与Sox9LKO小鼠体内利用Brd U标记方法检测敲除SOX9对胆管上皮细胞增殖能力的影响。3、在Sox9f/f小鼠与Sox9LKO小鼠体内利用免疫荧光共定位细胞增殖相关标志物—增殖细胞核抗原(PCNA)与胆管上皮细胞标志物—细胞角蛋白19(CK19),观察敲除SOX9对胆管上皮细胞增殖能力的影响。4、在Sox9f/f小鼠与Sox9LKO小鼠体内利用免疫荧光共定位细胞顶端极性标志物—骨桥蛋白(OPN)与胆管上皮细胞标志物—细胞角蛋白19(CK19),并且共定位细胞底端极性标志物—层粘连蛋白(Laminin)与胆管上皮细胞标志物—上皮细胞粘附分子(EpCAM),观察敲除SOX9对胆管上皮细胞极性的影响。5、在Sox9f/f小鼠与Sox9LKO小鼠体内利用免疫荧光共定位初级纤毛相关标志物—乙酰化-微管蛋白(AC-tublin)或ADP核糖基化因子相似蛋白-13B(ARL13B)与胆管上皮细胞标志物—细胞角蛋白19(CK19)或上皮细胞粘附分子(EpCAM),观察敲除SOX9对胆管上皮细胞初级纤毛形成的影响。6、在体外人肝内胆管上皮细胞中,通过小干扰RNA(siRNAs)敲减SOX9后,利用免疫荧光检测初级纤毛相关标志物AC-tublin的表达,观察敲减SOX9对胆管上皮细胞初级纤毛形成的影响。三、SOX9在肝囊肿形成中的作用机制研究1、利用EpCAM磁珠分选出6,12月龄Sox9f/f小鼠与Sox9LKO小鼠肝脏内EpCAM阳性的原代胆管上皮细胞并用流式细胞术检测,RT-qPCR鉴定Epcam、Ck19、Sox9 mRNA的表达情况。2、利用RT-qPCR检测Sox9LKO小鼠原代胆管上皮细胞和转染siSOX9的人肝内胆管上皮细胞中肝囊肿形成相关基因的表达水平(包括PKD1、PKD2、PRKCSH、SEC63、LRP5等)。3、利用Western blot检测HIBEpic细胞siSOX9后中SEC63蛋白的水平。4、利用JASPAR和h TFtarget数据库来分析推测SOX9与其可能的下游靶基因(SEC63、PKD1、LRP5)的结合位点。5、采用双荧光素酶报告基因测定法检测SOX9其对可能的下游靶基因(SEC63、PKD1、LRP5)的反式激活能力,并初步探究结合位点。6、观察在人原代胆管上皮细胞中过表达SEC63是否可以回复胆管上皮细胞中敲减SOX9对细胞增殖和纤毛形成的影响。四、统计学分析所有统计分析均采用SPSS 22.0软件进行。正态分布的数据采用Student’s t检验。若数据不服从正态分布,则采用非参数Mann-Whitney检验。动物相关的数据以平均值±标准误表示,其他数据以平均值±标准差表示。统计学检验为双侧检验,P值<0.05认为有统计学意义。【实验结果】一、肝脏特异性敲除Sox9小鼠自发形成肝囊肿1.通过Western blot、免疫组化和免疫荧光对SOX9蛋白水平的检测,证实在Sox9LKO小鼠肝脏组织中几乎不表达SOX9。2.通过大体观察和micro-CT扫描,3月龄Sox9LKO小鼠肝脏组织未见明显改变,6月龄Sox9LKO小鼠肝脏自发形成肝囊肿,且肝囊肿发生率、数量和大小随年龄增长而增加,Sox9f/f小鼠12月龄前未见囊肿。3、H&E染色与胆道标志物CK19免疫组化染色显示,Sox9LKO组小鼠从3月龄开始肝脏出现进行性胆管异常扩张,出现囊肿壁样改变。天狼星红染色显示,Sox9LKO小鼠肝脏胶原沉积增加。4.Sox9LKO小鼠与Sox9f/f小鼠相比,血清检测表现出ALP的增加,其他肝功能指标,包括ALT、AST、TBIL未见改变。二、敲除/敲减SOX9会导致胆管上皮细胞异常增殖、极性紊乱、初级纤毛形成减少1.在体外实验表明,敲减SOX9导致人原代胆管上皮细胞(HIBEpic)异常增殖。2.Brd U标记法检测显示,3月龄和6月龄的Sox9LKO小鼠肝脏中检测显示Brd U/CK19双阳性细胞增多,而在同月龄的Sox9f/f小鼠中未检测到Brd U信号。3.6月龄和12月龄Sox9LKO小鼠肝脏免疫荧光染色检测显示PCNA/CK19双阳性细胞增多,而Sox9f/f小鼠几乎未检测到PCNA染色。4.12月龄Sox9LKO小鼠肝脏免疫荧光染色观察到囊壁内皮细胞表现出较强的PCNA染色。5.在Sox9f/f小鼠肝脏中,组织免疫荧光染色显示顶端极性标志物OPN和底端极性标志物Laminin在胆管上皮细胞的顶端和底端正常表达,而6月龄Sox9LKO小鼠肝脏中,部分胆管上皮细胞顶端无OPN表达,底端Laminin染色增厚;12月龄Sox9LKO小鼠鼠胆管上皮细胞的顶端OPN定位错误,底端Laminin染色碎片化且增厚。6.在6月龄小鼠中,与Sox9f/f小鼠相比,Sox9LKO小鼠胆道上皮细胞中Ac-tubulin阳性或ARL13B阳性的初级纤毛显著减少,在12个月龄的Sox9LKO小鼠中,即使胆管处于增生状态,胆管上皮细胞中仍然没有初级纤毛。7、在体外,细胞免疫荧光染色结果显示,敲减Sox9的人原代胆管上皮细胞(HIBEpic)AC-tubulin阳性信号减少,表明初级纤毛形成减少。三、敲除/敲减SOX9可通过转录调控SEC63表达,从而导致肝囊肿形成1.磁珠分选细胞后,流式细胞术检测EpCAM阳性,RT-qPCR检测胆道标志物表达,证实成功分离出EpCAM阳性的小鼠原代胆管上皮细胞。2.RT-qPCR结果表明,相比于Sox9f/f的小鼠,在Sox9LKO小鼠的原代胆管上皮细胞中,PKD相关基因包括Pkd1和Pkd2,以及ADPLD相关基因,包括Sec63、Lrp5和Prkcsh mRNA水平明显降低。3.RT-qPCR结果表明,在体外HIBEpic中,敲减SOX9仅下调了SEC63 mRNA的水平,而PKD1、PKD2、LRP5、PRKCSH mRNA水平均未下调。4.Western blot也证实了在体外HIBEpic中,敲减SOX9后导致SEC63蛋白水平的下降。5.利用JASPAR和h TFtarget数据库来分析推测SOX9与下游靶基因的结合位点可能位于PKD1、SEC63和LRP5基因上游2kb区域。6、荧光素酶报告基因检测显示,SOX9的过表达仅增加了SEC63启动子报告基因的活性。并且在SEC63的启动子中发现了两个潜在SOX9的结合位点,当SEC63位点1突变后,其报告基因的活性明显减弱。7、细胞免疫荧光显示,过表达SEC63可以部分回复敲减SOX9对HIBEpic初级纤毛形成的抑制作用。8、体外CCK8检测显示,过表达SEC63可以部分回复敲减SOX9对HIBEpic细胞增殖的促进作用。【结论】1.肝脏特异性敲除Sox9小鼠自发形成肝囊肿;2.敲除/敲减SOX9会导致胆管上皮细胞异常增殖、极性紊乱、初级纤毛形成减少;3.敲除/敲减SOX9可通过转录调控SEC63表达,从而导致肝囊肿形成。