研究目的肺癌的恶性转移和复发是临床治疗过程中经常面临的棘手难题。探索肺癌全身转移的诱因、机制对于临床上肺癌的治疗及改善患者预后具有重要意义。低氧肿瘤微环境是肿瘤增殖、侵袭、转移的重要调节因素,而肿瘤新血管的生成是其中的基础。本研究旨在阐明低氧诱导线粒体中Akt2-PDK1通路调控YKL-40在肺癌侵袭性生长和血管新生中的作用,为临床上肺癌的治疗提供新的靶点和思路。实验方法1、比较强侵袭性肺癌细胞系CL1-5在常氧和低氧环境培养下,线粒体中Akt2和PDK1的富集和磷酸化水平,细胞内HIF-1α,YKL-40,VEGF,TGF-β等蛋白的表达和分泌。2、构建Akt2 sh RNA、YKL-40过表达慢病毒载体,转染CL1-5细胞系,比较Akt2干扰和/或YKL-40过表达对CL1-5细胞中PDK1磷酸化,YKL-40,VEGF,TGF-β等蛋白的表达和分泌的影响;通过CCK8,Transwell实验和成管能力检测等方法检测细胞活性、迁移、侵袭和血管新生能力。3、将上述处理细胞系分别构建裸鼠皮下荷瘤模型,观察Akt2干扰和/或YKL-40过表达的CL1-5细胞的成瘤能力。4、在第32天收集各组肿瘤组织,通过免疫印迹检测小鼠肿瘤中Akt2和PDK1的富集和磷酸化水平,YKL-40,VEGF,TGF-β等蛋白的表达,通过免疫组化比较各组肿瘤细胞的增殖活性和血管生成能力。实验结果1、低氧处理CL1-5细胞能明显增加线粒体中Akt2、PDK1的磷酸化水平,细胞内p-Smad3、YKL-40和HIF-1α蛋白表达增加,细胞TGF-β、YKL-40、VEGF的分泌增加。2、CL1-5细胞转染Akt2 sh RNA载体,并在低氧环境下处理24 h,Akt2、p-Akt2、YKL-40、p-Smad3、HIF-1α蛋白、N-cadherin和Vimentin表达均明显降低,E-cadherin蛋白表达增加。经过YKL-40过表达载体转染后,细胞YKL-40、N-cadherin、Vimentin蛋白明显增加,而E-cadherin蛋白表达却减少,Akt2和p-Akt2、p-Smad3、HIF-1α蛋白则无明显改变。收集上清Akt2 sh RNA稳转株细胞因子分泌降低,经过YKL-40过表达载体转染后,细胞TGF-β、YKL-40、VEGF分泌增加。3、低氧条件下Akt2干扰后,抑制了CL1-5细胞增殖、迁移、侵袭和小管生成;而YLK-40过表达能促进CL1-5细胞增殖、迁移、侵袭和小管生成。4、小鼠皮下注射各组处理的CL1-5细胞,Akt2 sh RNA稳转株注射小鼠肿瘤增长速度明显小于对照组,而经过YKL-40过表达病毒感染的Akt2 sh RNA稳转株注射小鼠肿瘤体积明显增大。第32天称量小鼠肿瘤,Akt2 sh RNA稳转株注射的小鼠肿瘤的重量明显小于对照组,而经过YKL-40过表达病毒感染的Akt2 sh RNA稳转株注射的小鼠肿瘤重量明显增加。5、与Scramble组的小鼠相比,Akt2 sh RNA组小鼠肿瘤的p-PDK1、HIF-1α、TGF-β、p-Smad3、YKL-40、N-cadherin、vimentin、VEGF蛋白表达均明显减少,而E-cadherin蛋白表达却相应增多。YKL-40过表达病毒感染的肿瘤Akt2、p-Akt2、p-PDK1、HIF-1α、p-Smad3、PDK1和Smad3蛋白无明显变化,TGF-β、YKL-40、N-cadherin、vimentin、VEGF蛋白表达均明显增多,而E-cadherin蛋白表达则出现减少。Akt2 sh RNA小鼠肿瘤Ki67阳性率明显下降,细胞增殖减少,v WF阳性表达明显出现降低,血管新生减少。与空载病毒感染组相比,YKL-40过表达病毒感染后的稳转株注射小鼠,肿瘤Ki67阳性率明显增加,说明细胞增殖增加,v WF阳性表达增加,说明血管新生增加。实验结论本研究发现肺癌细胞在低氧微环境下,通过线粒体中Akt2-PDK1聚集和磷酸化上调HIF-1α,YKL-40表达,促进肺癌细胞增殖、侵袭、迁移和血管新生。研究还通过构建干扰RNA和过表达载体,在细胞实验和动物实验水平验证Akt2-PDK1-YKL-40通路的存在和促进肺癌恶性表型的作用。