【摘 要】
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目的:养阴温阳方是本课题组筛选出的具有抗肺癌效果的中药复方。其具有益气养阴扶正祛邪的功效,本课题将从免疫角度出发,进行养阴温阳方抗肺癌机制的研究。方法:1.采用CCK8法、克隆形成实验、Hoechst染色和Annexin-V/PI流式细胞术来检测不同浓度的养阴温阳方对H460和Lewis细胞的活性和细胞凋亡的影响。2.建立小鼠皮下移植瘤模型,采用养阴温阳方体内干预Lewis荷瘤小鼠,处死后剥离瘤体
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目的:养阴温阳方是本课题组筛选出的具有抗肺癌效果的中药复方。其具有益气养阴扶正祛邪的功效,本课题将从免疫角度出发,进行养阴温阳方抗肺癌机制的研究。方法:1.采用CCK8法、克隆形成实验、Hoechst染色和Annexin-V/PI流式细胞术来检测不同浓度的养阴温阳方对H460和Lewis细胞的活性和细胞凋亡的影响。2.建立小鼠皮下移植瘤模型,采用养阴温阳方体内干预Lewis荷瘤小鼠,处死后剥离瘤体进行RNA-seq、HE染色,免疫荧光,免疫组化和Western blot检测。从小鼠体内剥离出脾脏进行流式实验。3.对体外提取诱导的BMCD细胞进行验证。根据CCK8和Annexin-V/PI流式细胞术来确定药物浓度,用流式细胞术检测养阴温阳方对树突状细胞干预后的表面因子CD40、MHCII、CD86和CD83的表达,用电镜和RT-PCR法检测DCs细胞中IL-5、IL-12、IL-1β、TNF-α和IFN-γ的表达。采用Western blot法检测养阴温阳方干预DCs中的Toll样受体4（TLR4）-MyD88-NF-κB和MAPK通路蛋白的影响。4.将养阴温阳方干预后的DCs分别与CD4和CD3共培养。采用CCK8、流式检测法和Elisa法分别检测T细胞的增殖与分化。检测CD4的增殖与分化,Th1型T细胞中IFN-γ、TNF-α、IL-2和Th2型T细胞中IL-4和IL-15细胞因子的变化。同时,检测CD8+T细胞中PERFORIN、GRANZYME的表达变化。结果:1.养阴温阳方在体外能够抑制人肺癌细胞株H460,小鼠肺癌细胞Lewis的增殖,H460和Lewis的IC50分别为84.39μg/ml和68.87μg/ml。并且抑制肺癌细胞克隆形成和促进肺癌细胞的凋亡。2.养阴温阳方在体内抑制C57BL/6小鼠皮下移植瘤的生长,瘤体免疫组化结果显示,养阴温阳方抑制Ki-67的表达;Western blot结果表明,养阴温阳方抑制Caspase3、Bax/Bcl2的表达。转录组测序通过KEGG和GO富集分析后显示,养阴温阳方的作用主要集中在免疫上。同时养阴温阳方增强小鼠肿瘤组织中DCs和T细胞的表达,并且增加小鼠脾脏中CD4、CD8和DCs的表达。3.从小鼠骨髓中提取小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）,进行细胞因子干预分化后,形态与纯度符合DCs的生长特性。基于CCK8分析和膜联蛋白V/PI检测,与对照组相比,养阴温阳方（50和100μg/ml）不会引起明显的细胞活力改变和凋亡,这表明imDCs的增殖和凋亡不受养阴温阳方的影响。养阴温阳方干预后会导致 CD11c+CD83/86/40+MHCⅡ+ DC表达量增加,并且 TNF-α,IFN-γ,IL-10,IL-12和IL-1β的mRNA水平升高。采用电镜技术,在镜下观察结果显示,养阴温阳方干预后树突状细胞中的溶酶体减少,并且在细胞膜表面长出了二级凸起。养阴温阳方可显著增加TLR4,MyD88,IKKα/β和NF-κB（p65）的水平,并降低IκBα表达。此外,养阴温阳方可促进了 JNK,ERK1/2和p38的磷酸化。4.养阴温阳方诱导后的imDC与同种CD3+T原代T细胞共培养后,能够增加PERFORIN和GRANZYME的表达。由此可知,养阴温阳方能够刺激CD3+T细胞分化为CD8+的CTL细胞。养阴温阳方干预后的DCs与同种CD4+原代T细胞共培养后,可显著增加CD4+T细胞的增殖,与此同时Th1型细胞因子（IL-2、IFN-γ和TNF-α）的分泌显著增加,Th2（IL-4和IL-15）没有明显的改变。结论:养阴温阳方能够通过通过MAPK和TLR4-MYD88-NF-κB信号促进DCs的成熟,从而提高了CD4+T细胞的比例并促进T细胞分化为Th1细胞和细胞毒性T细胞（CTL）,且提高了 Th1/Th2,达到抑制肿瘤增殖的作用。本研究的实验结果可以为肺癌免疫治疗提供了科学依据,运用现代医学的方法解释了中医“养阴温阳方”的科学本质,丰富了中医药学中“扶正祛邪”治疗肺癌的理论内涵。
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