论文部分内容阅读
背景癌症是威胁人类健康和生命的重大疾病。以化疗和放疗为主的传统治疗方法治疗具有较大的毒副作用,影响肿瘤患者的生活质量。因此迫切需要有效、低毒的治疗方法。过继性细胞疗法（Adoptive cell therapy,ACT）可以增强患者免疫功能,在减少肿瘤治疗相关副作用、预防复发和转移、提高生活质量、延长疗效等方面具有独特优势。ACT在临床应用中主要分为两种:一种是非特异性细胞治疗,如细胞因子诱导的杀伤（cytokine-induced killer,CIK）细胞疗法和自然杀伤（natural killer cell,NK）细胞疗法。另一种是特异性细胞疗法,如T细胞受体（T cell receptor,TCR）基因转导T细胞疗法和嵌合抗原受体T（chimeric antigen receptors T cell,CAR-T）细胞疗法等。在这些特异性过继性细胞疗法中,树突状细胞联合细胞毒性T淋巴细胞（dendritic cell-cytotoxic T lymphocytes,DC-CTLs）疗法具有独特的优势,可以通过激活主动和被动免疫机制调节患者的免疫功能。DC-CTLs细胞治疗不仅在血液系统疾病中显示出良好的效果,还在乳腺癌、黑色素瘤以及结直肠癌等实体瘤治疗上也有较好的效果。目前关于DC-CTLs细胞疗法的研究主要针对单一靶点,而实体瘤具有高度的异质性和个体化,因此需要开发新型的针对肿瘤异质性的细胞治疗。在本项研究中,我们主要针对肿瘤的异质性,通过超高效液相质谱获得肿瘤患者的多个具有免疫原性的抗原肽,然后将这些多肽负载DCs细胞上进行体外培养,进而诱导肿瘤抗原特异性CTLs,将细胞回输至患者体内,实现对实体瘤患者进行多靶点精准化治疗,为免疫治疗提供新思路。方法1、本研究从2020年11月至2021年6月在郑州大学第一附属医院招募了5名肿瘤患者进行负载多肽的树突状细胞诱导特异性CTLs治疗,所有患者在参加本研究前均签署了知情同意书。2、利用超高效液相色谱检测患者血清中肿瘤抗原,获取抗原多肽信息,之后根据检测结果进行患者个体化靶标多肽的制备。3、使用Ficoll密度梯度离心法获得患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。将PBMCs分为贴壁细胞和悬浮细胞进行培养。贴壁细胞DCs在培养期间需要添加细胞因子和个体化抗原肽刺激成熟,并用流式检测DCs的表面标志物。在第5天将培养成熟的DCs与悬浮细胞培养,诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte cells,CTLs）,第14天流式检测CTLs的CD28、CD69、PD-1、TIM-3等表面标记物及CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD56+免疫亚群的变化。4、采用流式细胞仪检测细胞治疗前后患者外周血PBMCs细胞亚群的变化。5、通过酶联免疫斑点实验（enzyme-linked immunospot,ELISPOT）评估CTLs或PBMCs的特异性杀伤功能。6、采用流式细胞仪检测细胞治疗前后患者外周血样品中细胞因子表达的变化,包括IL-4、IL-2、IFN-γ、perforin和Granzyme B。7、采集治疗前后患者外周血,进行T细胞受体多样性（T cell receptor,TCR）测序分析。8、收集细胞治疗前后患者血常规、肝肾功能及血清肿瘤指标并观察这些指标的变化。9、观察患者接受细胞治疗后的不良反应,随访并评估患者生活质量。结果1、DCs经体外培养5天后表面成熟标记物阳性率较高,表明DCs培养成熟。2、CTLs经体外培养14天后CD3+CD8+细胞亚群比例显著升高,并且CTLs细胞表面激活因子表达较高,抑制因子较低。3、ELISPOT体外实验检测细胞功能发现体外培养后的CTLs对抗原肽的杀伤能力显著提高。4、DCs和CTLs细胞回输前的质检结果显示所有回输的细胞内毒素和真菌葡聚糖水平均在标准范围以内。5、流式检测结果显示与细胞治疗前相比,治疗后患者外周血CD4+/CD8+比例显著升高,CD3-CD56+细胞亚群的表达也有上升趋势。IL-2、IFN-γ、perforin和Granzyme B等功能因子表达升高,IL-4抑制因子的表达水平降低。6、ELISPOT实验结果表明与细胞治疗前相比,治疗后患者后对于肿瘤抗原肽的免疫应答反应性更强。7、TCR测序结果显示与细胞治疗前相比,治疗后患者外周血TCR多样性有升高的趋势。8、检验结果显示与细胞治疗前相比,治疗后患者的肿瘤标志物和循环肿瘤的数目呈下降趋势。9、所有患者在细胞治疗后没有出现严重不良反应,表明负载多肽的树突状细胞诱导特异性CTLs治疗的副作用较小,具有一定的安全性。10、随访结果表明与细胞治疗前相比,治疗后患者的生活质量得到了一定的改善。例如食欲提高、改善睡眠、体重增加,患者主观感觉和生活质量明显改善。结论经过体外培养后,DCs具备成熟的表型,CTLs对肿瘤抗原具有更高的毒性。细胞回输后患者外周血功能因子表达升高,对特异性肿瘤抗原免疫应答能力更强,并且TCR多样性也有升高的趋势。负载多肽的树突状细胞诱导的特异性CTLs细胞治疗可以提高患者的免疫功能,在一定程度上可以延长患者的生存周期,提高生活质量,并且治疗的副作用小,具有一定的安全性,这可能为癌症的个体化治疗提供一种策略。