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背景:帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是世界第二大与衰老相关的神经退行性疾病,以黑质致密部（SNpc）多巴胺能神经元进行性丢失为主要病理特征。目前为止,PD尚无理想的治疗方法,多巴胺替代疗法已被大多数临床用于缓解PD的运动症状,然而它不能延缓PD的病理进程,长期使用会导致一系列的副作用。目前,PD病理进程中多巴胺能神经元变性死亡的分子机制尚未完全阐明,可能包括神经细胞凋亡、线粒体功能异常、氧化应激、自由基清除能力下降和中枢神经系统（Central Neural System,CNS）炎症等机制。其中,中枢神经炎症在PD发病机制中发挥重要的作用,抑制神经炎症反应可以保护多巴胺能神经元。研究表明,PD早期即出现神经炎症反应,且多种神经细胞都参与促炎因子释放,如白介素-1β（Interleukin 1β,IL-1β）、白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等。鞘氨醇（Sphingosine）又称神经鞘氨醇,是含有不饱和烃基链的十八碳氨基醇,也是细胞膜的成分之一。鞘氨醇可由鞘氨醇激酶-1（Sphingosine Kinase 1,Sphk1）和Sphk2两种激酶磷酸化后生成鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate,S1P）,所产生的S1P与细胞膜上S1P受体结合并发挥不同作用,如细胞迁移、增殖、存活和分化。FTY720是S1P结构类似物,是一种新型的免疫抑制剂,磷酸化的FTY720可与S1P1受体结合而发挥效应,有报道证实FTY720对CNS炎症动物模型有较好的治疗效果。然而,关于鞘氨醇信号对PD的作用机制知之甚少。第一部分鞘氨醇激酶-1在MPTP诱导的帕金森动物模型中的作用及机制研究目的:本研究旨在探索鞘氨醇激酶-1缺失在MPTP诱导的帕金森病模型小鼠中的作用及其机制。方法:将8周龄雄性C57BL/6J小鼠和Sphk1-/-小鼠分成对照组和模型组,对照组皮下注射生理盐水,模型组皮下注射MPTP（20mg/kg）,持续给药5天,在末次给药后第7天取样。通过旷场实验和转棒实验对四组小鼠进行行为学评估;免疫组化TH染色观察多巴胺能神经元凋亡数量;高效液相色谱检测多巴胺及其代谢产物单胺类神经递质含量;免疫荧光观察Iba-1阳性细胞数量;ELISA检测四组小鼠中脑TNF-α、IL-6和IL-1β的表达变化;培养小鼠小胶质细胞系BV2,BV2细胞用PF-543或相同量生理盐水预处理BV2细胞30分钟,随后加入MPP+刺激12小时,ELISA检测四组小鼠中脑TNF-α、IL-6和IL-1β的表达变化;用PF-543或等量生理盐水预处理BV2细胞30分钟,随后加入500μM MPP+刺激3小时或6小时,通过Western Blot检测NF-κB、STAT3以及TRAF2等信号分子;用PF-543或等量生理盐水预处理BV2 30分钟,随后加入MPP+和S1P,共同刺激6小时,随后通过Western Blot检测NF-κB、p-AKT以及TRAF2等信号分子;回补S1P后,通过Western Blot检测ERK、AKT、NF-κB和STAT3等信号分子的表达。结果:在体内实验中,Sphk1缺失可以改善MPTP诱导的帕金森病模型小鼠的行为障碍;减少多巴胺能神经元凋亡数量;增加单胺类递质含量;抑制小胶质细胞的激活和炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。体外实验中,抑制Sphk1显著降低MPP+引起的炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌;降低NF-κB、STAT3的磷酸化水平以及TRAF2的表达;回补S1P后,观察到S1P会导致NF-κB、AKT等信号分子的磷酸化水平增加。结论:Sphk1主要通过生成S1P来引起下游信号通路激活,Sphk1缺失可以减少TRAF2的表达,降低NF-κB、STAT3等信号分子的磷酸化水平,减少炎性因子释放,抑制小胶质细胞的激活,继而降低中枢神经系统的炎性水平,对多巴胺能神经元发挥神经保护作用,最终改善MPTP诱导帕金森病模型小鼠的行为障碍。第二部分 FTY720抑制小胶质细胞激活对帕金森病起到神经保护作用及机制研究目的:探讨S1P类似物FTY720能否通过抑制小胶质细胞的激活,继而对MPTP诱导的帕金森病模型小鼠产生影响,为临床提供一种治疗帕金森病的方法。方法:将8周龄雄性C57BL/6J小鼠,随机分为对照组、FTY720组、MPTP模型组和治疗组。模型组小鼠皮下注射MPTP（20 mg/kg）,治疗组提前30分钟灌胃FTY720（2 mg/kg/day）,然后皮下注射MPTP（20 mg/kg）,对照组与FTY720分别皮下注射和灌胃相同剂量的无菌生理盐水,上述实验持续5天,末次给药后第7天,麻醉小鼠提取样本。通过旷场实验和转棒实验对四组小鼠行为学进行评价;用免疫组化TH染色方法,观察中脑黑质区多巴胺能神经元凋亡数量。高效液相色谱检测纹状体中多巴胺及其代谢产物单胺类递质的含量。免疫荧光Iba-1标记小鼠中脑黑质区小胶质细胞,观察其激活情况。提取中脑,用ELISA检测脑中TNF-α、IL-6和IL-1β的表达变化。在体外培养小鼠小胶质细胞BV2,用0.5μM FTY720或等量生理盐水预处理30分钟,随后加入500μM MPP+,刺激12小时,使用ELISA检测炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达变化。提取刺激12小时的BV2上清作为条件培养基（CM）,作用于SH-SY5Y细胞系中12小时,用Hoechst荧光染色观察凋亡细胞。同时,采用Annexin-V和PI双染并结合流式细胞仪检测细胞凋亡率。通过Western Blot检测PI3K/AKT/GSK-3β和STAT3信号分子的磷酸化水平。Mit SOX探针检测不同组BV2中ROS含量。通过Western Blot检测p65/NLRP3/Caspase-1蛋白水平。结果:FTY720显著缓解由MPTP造成的帕金森病小鼠的行为障碍,治疗组小鼠场地行动路程和速度以及棒上停留时间和速度均明显增加;与模型组相比,小鼠中脑黑质区多巴胺能神经元凋亡数量减少;高效液相HPLC结果显示,FTY720部分逆转MPTP引起的多巴胺及其代谢产物含量的降低;同时,Iba-1标记的小胶质细胞的激活数量显著降低,并且炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β表达水平也降低。体外实验中,FTY720可以抑制MPP+刺激后小胶质细胞系BV2炎性因子水平的增加;利用BV2的培养基作为条件培养基作用于SH-SY5Y细胞系,Hoschet荧光染色结果显示,FTY720处理的BV2细胞培养基可以减少SH-SY5Y细胞凋亡数量;Annexin-V和PI双染后流式细胞仪检测的细胞凋亡率也减少;同时,FTY720预处理后,经MPP+刺激的BV2中PI3K/AKT/GSK-3β和STAT3信号分子的磷酸化水平也降低;Mit SOX探针检测结果显示治疗组细胞的ROS含量显著低于模型组;同时,FTY720可以降低p65磷酸化水平和NLRP3炎症小体活化水平,从而减少Caspase-1的产生。结论:FTY720可以改善MPTP（MPP+）导致的小胶质细胞线粒体功能障碍和p65磷酸化水平,通过抑制小胶质细胞的NLRP3炎症小体的激活,减少脑组织中炎性因子的表达,可间接降低多巴胺能神经元的凋亡并增加多巴胺及其代谢产物单胺类递质的含量,从而改善帕金森病小鼠的行为学障碍。