【摘 要】
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目的:在结直肠癌中检测PCSK4的表达,分析PCSK4表达与结直肠癌患者预后的相关性。探讨PCSK4对结直肠癌细胞功能的影响及其机制。方法:1.通过挖掘 Gene Expression Omnibus（GEO）与 The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据,探讨PCSK4在结直肠癌中的表达情况,统计分析其与患者预后的相关性。并利用Western blot、qPCR、免疫组织化学
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目的:在结直肠癌中检测PCSK4的表达,分析PCSK4表达与结直肠癌患者预后的相关性。探讨PCSK4对结直肠癌细胞功能的影响及其机制。方法:1.通过挖掘 Gene Expression Omnibus（GEO）与 The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据,探讨PCSK4在结直肠癌中的表达情况,统计分析其与患者预后的相关性。并利用Western blot、qPCR、免疫组织化学、组织切片免疫荧光在结直肠癌组织与细胞中进行验证。2.对PCSK4表达水平较高的结直肠癌细胞系采用慢病毒侵染方法获得PCSK4稳定下调的结直肠癌细胞株,并利用Western blot与qPCR验证下调效果。3.构建过表达PCSK4的载体质粒,对PCSK4表达水平较低的结直肠癌细胞系进行转染,并利用Western blot与qPCR检验PCSK4上调效果。4.采用克隆形成、CCK8实验、Transwell及划痕实验检测PCSK4的上调或者下调对结直肠癌细胞增殖、侵袭与迁移的影响。5.对GEO及TCGA数据进行基因集富集分析（GSEA）探讨PCSK4可能能够调控的信号通路,并利用Western blot与qPCR检测PCSK4的上调或者下调对通路中各分子的表达影响。6.采用已经文献报道的通路抑制剂处理PCSK4上调或下调的结直肠癌细胞,观察细胞增殖、侵袭、迁移能力的变化。此外,Western blot检测通路分子的表达变化。7.质谱技术鉴定与结直肠癌细胞内源性PCSK4存在相互作用的蛋白并进行GO/KEGG富集分析,并利用Western blot与qPCR技术检测PCSK4对细胞功能标志基因的影响,以探讨PCSK4对于更多的细胞功能的作用。结果:1.GEO与TCGA数据分析结果均显示PCSK4在结直肠癌中高表达,并且利用结直肠癌临床样本及细胞系得到了证实。PCSK4高表达与结直肠癌患者较短生存期显著相关,发生淋巴结转移的结直肠癌患者PCSK4表达更高。2.构建了 PCSK4稳定下调的HCT116细胞株,对于PCSK4表达水平较低的SW620作为过表达PCSK4的对象。3.克隆形成实验与CCK8实验均显示上调了 PCSK4的SW620增殖能力提高,下调了PCSK4的HCT116细胞增殖能力则降低。4.Transwell和划痕实验分别表明上调了 PCSK4的SW620侵袭与迁移能力增强,而下调了 PCSK4的HCT116细胞侵袭与迁移能力则减弱。5.GEO数据的GSEA结果提示PCSK4可能与细胞周期存在关联,Western blot与qPCR发现PCSK4能够促进细胞周期蛋白cyclin D1的表达,同时抑制p21和p27的表达。6.PCSK4互作蛋白的GO/KEGG分析结果显示在细胞粘附分子结合、cadherin结合得到富集,Western blot与qPCR实验结果表明PCSK4可抑制 E-cadherin 表达,同时促进 α-catenin、β-catenin、vimentin、snail等上皮间质转化相关基因的表达。7.TCGA与GEO数据GSEA结果提示PCSK4与PI3K/AKT通路可能相关,Western blot发现PCSK4可提高mTOR、FOXO1、AKT、GSK-3 β的磷酸化水平。并且AKT的抑制剂LY294002逆转了这一效果,同时抑制了 PCSK4的促进结直肠癌细胞增殖的作用。8.mTOR的抑制剂雷帕霉素逆转了 PCSK4降低E-cadherin表达以及促进vimentin、snail表达的作用,同时抑制了 PCSK4促进结直肠癌细胞增殖与侵袭的能力。结论:PCSK4在结直肠癌中高表达且与预后不良呈正相关。PCSK4能够促进结直肠癌细胞迁移与细胞周期转变,并且通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭以及上皮间质转化（EMT）。
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