花生白藜芦醇合酶基因的克隆及原核表达

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白藜芦醇(三羟基反式芪)存在于少数几种植物中,是一种植物抗毒素,同时药理学的研究表明,它具有抗癌抗心血管疾病等生理活性.白藜芦醇合酶是催化合成白藜芦醇的关键酶,对该酶及其基因的研究既有助于更深入地了解该酶的催化合成机理,又有助于进行转基因提高其它作物的抗病性.该实验的目的是从花生中克隆白藜芦醇合酶基因,并在大肠杆菌中表达该基因,为以后开展转基因工作以及探索酶的功能的工作奠定基础.该实验使用反转录PCR(RT-PCR)的方法,从花生中提取mRNA,反转录为cDNA,利用白藜芦醇合酶基因特异性的引物从中扩增出目的基因.将目的基因克隆到T-载体pMD-18T上,送检测序.结果表明,目的基因的长度为1170bp,编码390个氨基酸,与Genbank中已有的几个花生白藜芦醇合酶基因的氨基酸序列的相似性为93%-96%.将目的基因亚克隆到表达载体pQE30-a上,转化到大肠杆菌M15中,经测序表明,目的基因序列及读码框均正确,表达载体构建成功.用IPTG诱导重组菌,目的蛋白表达量达到菌体总蛋白的24%,超声波破碎菌体,收集可溶蛋白,用组氨酸亲和柱纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳得到单一的目的条带.该实验成功获得花生白藜芦醇合酶基因,并在大肠杆菌中实现了大量表达.
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