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研究背景:血小板生成素（thrombopoietin,TPO）是调节巨核细胞增殖分化并参与介导血小板生成的一种特异性造血生长调控因子。TPO能与其受体（c-Mpl）高亲和力结合,激活巨核细胞-血小板中相应信号通路,促进巨核细胞分化成熟和调节血小板生成。当归多糖（Angelica polysaccharide Sinesis,APS）能够增强巨核细胞-血小板的生成并诱导巨核细胞增殖分化,血小板表面表达TLR4受体,且APS可以增强TLR4 mRNA的表达。故推测TPO和APS通过与其相应受体结合,激活血小板下游相关信号通路发挥对血小板抗凋亡的保护作用。TPO和APS都具有细胞水平、小鼠体内促进巨核细胞增值分化和血小板生成的作用;但TPO、APS对体外血小板的研究尚无报道。本课题主要研究TPO、APS对体外冷藏血小板的抗凋亡作用及信号通路机制,为延长血小板体外保存时间提供新方法和理论依据。研究目的:1、证明TPO和APS对体外冷藏血小板具有保护作用。2、探索TPO和APS抑制LY294002诱导的体外冷藏血小板凋亡的作用机制。研究方法:一、TPO和APS对体外冷藏血小板的影响1、检测血小板膜糖蛋白CD41、CD61的活性表达探索LY294002作用于体外冷藏血小板的最佳抑制浓度模型。2、检测血小板凋亡率探索TPO、APS分别作用于体外冷藏血小板的最佳保护浓度模型。3、显微镜下血小板形态学的观察。4、检测TPO、APS分别对体外冷藏血小板凋亡率的变化、Caspase-3凋亡蛋白酶的活化表达以及线粒体膜电位的变化情况。二、TPO和APS抑制LY294002诱导体外冷藏血小板凋亡的分子作用机制采用Western blot实验方法检测TPO、APS对血小板PI3K/AKT信号通路的影响。研究结果:一、TPO、APS对体外冷藏血小板的影响1、流式结果图显示:不同浓度的LY294002作用于体外冷藏血小板3d后,随着LY294002作用浓度的逐渐升高,在5-20μmol/L范围内,血小板膜糖蛋白CD41、CD61的活性表达率逐渐下降（r=-0.983）,当LY294002作用浓度增加到一定程度时,血小板膜糖蛋白的活性表达率下降趋势不明显。综合考虑20μmol/L的LY294002作为最佳抑制剂造模条件。2、流式结果图显示:TPO和APS均呈浓度依赖性地对抗LY29400诱导的血小板凋亡,当TPO和APS增加到一定浓度,其对抗效果趋向平缓。综合考虑50ng/mLTPO和100μg/mLAPS为血小板抗凋亡的最佳保护浓度。3、正常血小板形态圆盘状,规则,边缘整齐,瑞氏染色呈淡蓝色胞浆含紫红色颗粒,折光性好,立体感强;凋亡血小板形态皱缩,胞浆染色变深,紫红色颗粒增多,透光性差;结果显示:TPO、APS组正常血小板数量比例较多,对照组和LY294002组的血小板多数处于凋亡状态,且LY294002组较对照组凋亡状态明显。4、检测血小板凋亡率结果显示:①与Control组（15.97±1.40）%相比,LY294002组的血小板凋亡率（20.90±3.00）%明显升高,P＜0.05;TPO组的血小板凋亡率（5.47±0.49）%明显下降,P＜0.01;APS组的血小板凋亡率（6.03±0.59）%明显下降,P＜0.05;②与 LY294002 组（20.90±3.00）%相比,LY294002+TPO组的血小板凋亡率（6.03±0.15）%明显下降,P＜0.05;LY294002+APS组的血小板凋亡率（6.60±0.66）%明显下降,P＜0.05;这提示TPO、APS对体外冷藏血小板具有保护作用。5、血小板Caspase-3凋亡蛋白酶表达结果显示:①与Control组（46.53±2.87）%相比,LY294002 组的 Caspase-3 凋亡蛋白酶（56.70±1.85）%明显升高,P＜0.05;TPO组的Caspase-3凋亡蛋白酶（28.40±1.51）%明显下降,P＜0.05;APS组的Caspase-3凋亡蛋白酶（30.30±0.53）%明显下降,P＜0.05;②与 LY294002 组（56.70±1.85）%相比,LY294002+TPO 组的Caspase-3 凋亡蛋白酶（30.07±4.75）%明显下降,P＜0.05;LY294002+APS组的Caspase-3凋亡蛋白酶（31.73±3.01）%明显下降,P＜0.05;说明TPO和APS能够通过减少凋亡蛋白酶Caspase-3的活化表达抑制血小板的体外凋亡。6、线粒体膜电位变化结果显示:①与Control组（14.90±0.36）%相比,LY294002组线粒体膜电位下降比例（19.20±0.90）%明显升高,P＜0.05;TPO组线粒体膜电位下降比例（6.87±0.38）%明显下降,P＜0.01;APS组线粒体膜电位下降比例（6.67±0.45）%明显下降,P＜0.01;②与LY294002组（19.20±0.90）%相比,LY294002+TPO组线粒体膜电位下降比例（7.40±1.35）%明显下降,P＜0.01;LY294002+APS组线粒体膜电位下降比例（7.47±0.42）%明显下降,P＜0.01;提示TPO和APS能够通过减少线粒体膜电位降低抑制血小板的体外凋亡。二、TPO、APS对体外冷藏血小板抗凋亡作用的分子机制LY294002通过抑制血小板PI3K/AKT信号通路的活化诱导血小板凋亡;而TPO、APS能够活化PI3K/AKT信号通路的表达抑制LY294002诱导的血小板凋亡。研究结论:1、TPO、APS对体外冷藏血小板具有保护作用。2、TPO、APS对体外冷藏血小板的保护作用可能是通过活化PI3K/AKT信号通路,抑制血小板Caspase-3凋亡蛋白酶的活化表达和稳定线粒体膜电位发挥对体外冷藏血小板抗凋亡的保护作用。