论文部分内容阅读
胶质瘤（Glioma）是中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）的恶性肿瘤,属于预后较差、复发风险高和死亡率高的颅内肿瘤。尽管,手术、放疗、化疗和免疫治疗等胶质瘤临床治疗手段取得了一定的进展,但目前胶质瘤病患的获益仍然十分有限,中位生存期仅有15个月[1]。血脑屏障（Blood Brain Barrier,BBB）和肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）中的免疫抑制是造成这一困境的主要原因。其中,BBB阻止了大多数小分子和几乎所有大分子药物到达脑组织,而TME诱导耐受性的树突状细胞（Dendritic cells,DCs）的产生,促进肿瘤细胞免疫逃逸。因此,如何穿越血脑屏障,并改善免疫抑制是提高胶质瘤治疗效应的关键。得益于纳米医学的发展,纳米载体,特别是仿生纳米载体,如天然聚合物纳米粒、蛋白质纳米粒、细胞外囊泡和细胞膜包覆的纳米粒,已被开发用于跨越血脑屏障实现中枢神经系统的药物递送。其中,细胞膜包被的纳米粒由于不仅具有纳米效应,还具有来源细胞的特定生物学效应,因此备受关注。已有研究表明,免疫细胞可以响应肿瘤微环境招募,从而穿过血脑屏障浸润于胶质瘤组织,这意味着免疫细胞膜包覆的纳米粒具有透BBB和胶质瘤微环境靶向的巨大潜力。DCs专门识别肿瘤细胞表达的肿瘤抗原,然后以抗原肽-主要组织相容性复合物（p MHC）分子的形式在细胞表面处理和呈递肿瘤抗原,之后,成熟的DCs引发抗原特异性T细胞的不同亚群以杀死同源肿瘤细胞。基于此,DCs可以在体外进行加工活化,并应用于设计仿生纳米粒。受此想法的启发,本课题研究了一种肿瘤抗原活化成熟的DC膜（a DCM）修饰载雷帕霉素（RAPA）的聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）纳米平台a DCM@PLGA/RAPA。以期通过a DCM@PLGA/RAPA纳米平台具有激活天然T细胞的抗原呈递能力,同时将药物输送到肿瘤病灶以进行联合抗胶质瘤治疗。以下为主要研究内容和结论:（1）活化树突状细胞（a DCs）的构建及表征:通过与胶质瘤细胞裂解液共培养的方式使DCs在体外进行抗原提呈并进一步活化成熟（a DCs）,活化成熟后表面共刺激分子（CD80/86）通过流式细胞仪（FCM）检测,相比未活化未成熟的DCs（i DCs）有明显上升;同时,共聚焦显微镜（CLSM）表征了DCs将肿瘤抗原提呈到膜上的静态过程,SDS-PAGE进一步表征了a DCs相比于i DCs膜表面具有与肿瘤细胞裂解液（Tumor cell lysate,TCL）相重叠的蛋白条带,说明DCs与TCL可以通过体外共培养的方式进行抗原提呈。（2）a DCM@PLGA/RAPA的制备及表征:将PLGA作为载体并通过纳米沉淀法制备装载RAPA的纳米药物PLGA/RAPA,测得载药量为11.35%,包封率为57.55%,进一步采用共挤出的方式将活化成熟的树突状细胞膜（a DCM）与PLGA/RAPA通过反复多次挤出制备得到纳米仿生纳米药物a DCM@PLGA/RAPA。DLS表征其粒径为127.9±1.5 nm,Zeta电位为-23.2±1.0 m V,TEM表征显示a DCM@PLGA/RAPA具有清晰的“壳-核”结构,同时荧光共定位表征a DCM@PLGA/RAPA被细胞摄取后仍然具有结构的完整性;此外,流式细胞术表明a DCM@PLGA/RAPA在制备过程中,a DCs的表面特异性蛋白（CD11c,MHC-II,CD86和CD80）没有被破坏。（3）a DCM@PLGA/RAPA的同源靶向性评价:由Di I标记的a DCM,根据a DCM@PLGA/RAPA被胶质瘤细胞（C6）和乳腺癌细胞（4T1）摄取的情况,探究a DCM@PLGA/RAPA的同型靶向能力,结果表明a DCM@PLGA/RAPA被C6摄取的量明显高于4T1,另外,使用4T1裂解液负载的a4T1DCM@PLGA/RAPA,探究被C6细胞和4T1细胞摄取的差异,结果表明,a4T1DCM@PLGA/RAPA被4T1摄取的量明显高于C6,由此,证明了提呈了相关肿瘤细胞抗原蛋白的a DCM@PLGA/RAPA对此种肿瘤细胞具有同型靶向的能力。（4）a DCM@PLGA/RAPA透BBB评价:利用transwell模拟体外BBB模型,探究a DCM@PLGA/RAPA透过体外BBB能力,结果表明在transwell模型中a DCM@PLGA/RAPA可被下室C6细胞吸收,同时C6细胞对a DCM@PLGA/RAPA的吸收明显高于i DCM@PLGA/RAPA,进一步说明a DCM@PLGA/RAPA具有同源靶向性。体外透BBB模型采用原位胶质瘤小鼠,通过尾静脉注射相应药物探究体内a DCM@PLGA/RAPA透BBB能力,小动物实体成像结果显示,相比于free Di R和PLGA/Di R,a DCM@PLGA/RAPA能够透过BBB并在小鼠脑部聚集,同时,离体脑组织荧光成像也应证这一结果,本实验从体外和体内探究了a DCM@PLGA/RAPA透过BBB的能力。（5）a DCM@PLGA/RAPA激活免疫反应评价:a DCM@PLGA/RAPA可以通过直接和间接的方式激活T细胞,直接的方式为:a DCM表面的CD80/CD86和p MHC分子与T细胞上的CD28 T细胞受体（TCR）识别后相互作用,促进T细胞活化;结果通过对不同组肿瘤浸润CD3+CD8+T细胞的比例以及相关细胞因子（IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ）的分泌对比证明a DCM可以促进T细胞的肿瘤浸润。间接的方式为:a DCM@PLGA/RAPA被骨髓来源的树突状细胞（Bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs）BMDCs摄取,刺激BMDCs成熟后进而促进T细胞活化;结果通过对不同组处理后BMDCs成熟度的统计以及细胞因子（TNF-α、IL-6）的分泌证明a DCM可以促进未成熟DCs进一步成熟,从而发挥抗原提呈的作用去激活T细胞。（6）体内药效学实验:相比于saline组,free RAPA以及PLGA/RAPA组增长缓慢,a DCM@PLGA/RAPA组处理的荷瘤小鼠脑部生物发光强度最低,说明脑部肿瘤生长显著减小。另外,a DCM@PLGA/RAPA组的存活时间显著高于对照组,其中位生存期为29天。全脑切片的H＆E结果显示a DCM@PLGA/RAPA组胶质瘤细胞排列稀疏,同时,Ki67和GFAP的免疫组化结果显示a DCM@PLGA/RAPA能有效抑制肿瘤细胞的恶性增殖。（7）体内预防实验:a DCM@PLGA提前免疫后的小鼠,在肿瘤细胞C6-Luc攻击后,脑部荧光相比于saline组,PLGA组增长速度明显缓慢。生存曲线也表明a DCM@PLGA组的存活时间显著高于对照组,而且出现肿瘤消融的小鼠,生存期延长,并且对存活小鼠进行追踪观察,在三个月内未出现转移和复发。肿瘤浸润T细胞结果显示a DCM@PLGA组CD3+CD8+T细胞的比例显著高于对照组。同时,a DCM@PLGA组相关细胞因子分泌量也显著高于对照组。说明a DCM@PLGA提前免疫的小鼠体内免疫系统被激活,在应对肿瘤攻击时具有较强的免疫能力。