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背景与目的多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是由骨髓中浆细胞异常增殖和单克隆免疫球蛋白（M蛋白）过度产生引起的恶性肿瘤,是第二大常见的血液系统恶性肿瘤。据全球癌症报告,2020年因MM死亡117077人,占所有癌症死亡人数的1.2%。尽管通过引入自体干细胞移植、免疫调节药物、蛋白酶体抑制剂以及单克隆抗体等治疗方法,MM患者的中位生存期已大大延长,但其依旧不可治愈。MM是一种富含血管的肿瘤,血管生成不仅参与了MM的进展,而且决定了其治疗效果和预后。因此,MM血管生成机制的探究对改善该疾病的治疗模式以及患者的预后具有重要意义。近年来越来越多的研究表明,肿瘤微环境中多种成分参与了肿瘤的血管生成。肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts,CAFs）是肿瘤微环境中的一个异质性群体。CAFs中成纤维细胞活化蛋白（fibroblast activation protein,FAP）、成纤维细胞特异性蛋白（fibroblast-specific protein-1,FSP-1）和α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin,α-SMA）高表达,可用于CAFs的鉴定。正常成纤维细胞（normal fibroblasts,NFs）是CAFs最主要的来源。近年来研究发现,miR-21、miR-199a以及miR-214等非编码RNA的失调参与了CAFs的形成。CAFs可以通过多种机制调控肿瘤的生物学行为,促血管生成是CAFs调节肿瘤发生发展的一个重要功能。有研究发现CAFs来源的微小RNA（micro RNA,miRNA）与其促血管生成作用密切相关,异常表达的miRNA可以通过作用于血管内皮细胞,调控肿瘤的血管生成。外泌体是肿瘤微环境的一个重要组成成分,它能够携带来源细胞内的DNA、lnc RNA、miRNA等物质进入受体细胞,介导细胞间的物质信息传递。外泌体中研究最为广泛的核酸类物质为miRNA,外泌体miRNA可以促进肿瘤的血管生成。研究发现CAFs外泌体来源的miRNA能够通过与肿瘤细胞进行细胞-细胞间通讯调控肿瘤的生物学行为。miR-21在包括MM在内的多种肿瘤中异常高表达,是最早被实验验证的原癌miRNA之一。研究表明miR-21与血管内皮细胞的激活、增殖、迁移、凋亡密切相关,可促进血管生成,增加血管密度。然而,目前有关CAFs外泌体miR-21在MM血管生成中发挥的作用尚不明确。前期我们发现MM的肿瘤微环境中存在较多CAFs,且CAFs与MM血管生成相关。此外,我们从数据库中筛选了CAFs外泌体中与血管生成相关的miRNA,发现miR-21是CAFs外泌体中与血管生成关系最为密切的miRNA。因此,本研究在前期研究的基础上,实验验证了CAFs外泌体miR-21对MM血管生成的影响。第一部分,通过调节NFs中miR-21的表达,探究miR-21对NFs活化为CAFs的影响;第二部分,为了更好的模拟肿瘤微环境,使用MM细胞系RPMI-8226细胞上清液配制的条件培养基（conditioned medium,CM）培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）,将其诱导成为骨髓瘤相关内皮细胞（myeloma-associated endothelial cells,MMECs）;第三部分,通过CAFs外泌体培养MMECs,获得外泌体-MMECs（exosomes-MMECs,E-MMECs）,然后通过调节E-MMECs中miR-21的表达,探究CAFs源性外泌体miRNA-21对MM血管生成的影响。本研究以期为临床通过阻断血管生成治疗MM提供新的理论依据。研究方法1.原代NFs和CAFs的分离与鉴定分别收集营养不良性贫血患者和初诊MM患者的新鲜骨髓液,通过Ficoll密度梯度离心获得骨髓单个核细胞（bone marrow mononuclear cells,BMMCs）。经三次差速贴壁从BMMCs中纯化出成纤维细胞,将营养不良性贫血患者来源的成纤维细胞标记为NFs,初诊MM患者来源的成纤维细胞标记为CAFs。采用免疫细胞荧光和Western blot检测NFs和CAFs中α-SMA、FAP蛋白的表达,对NFs和CAFs进行鉴定。2.调节miR-21表达对NFs活化为CAFs的影响q RT-PCR检测NFs和CAFs细胞中miR-21的表达。分别向NFs中转染mimic NC、miR-21 mimic、inhibitor NC、miR-21 inhibitor。应用q RT-PCR检测各组细胞内miR-21的表达。采用Western blot检测各组细胞中α-SMA、FAP蛋白的表达。3.外泌体的提取与鉴定使用Exo Quick-TC试剂盒分别从NFs和CAFs上清液中分离外泌体,透射电子显微镜观察其形态结构,NTA检测其粒径大小分布情况,Western blot检测其表面外泌体标志物CD63和CD81的表达,对外泌体进行鉴定。4.诱导MMECs细胞及功能鉴定收集RPMI-8226细胞上清液,制备CM,培养HUVECs细胞24h后,将获得的细胞标记为MMECs。利用CCK-8增殖实验、划痕实验、Transwell侵袭实验检测HUVECs与MMECs的增殖、迁移和侵袭能力。利用q RT-PCR检测HUVECs与MMECs中肿瘤相关内皮细胞标志物（tumor endothelial marker,TEM）5和7的表达。利用ELISA法检测HUVECs与MMECs上清液中血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGFA）的含量。5.CAFs源性外泌体对MMECs的影响采用q RT-PCR检测NFs和CAFs外泌体中miR-21的表达。分别将CAFs外泌体,去除外泌体的CAFs上清液与MMECs共培养48h,依次标记为CAF exo组、CAF exo-depl组。另将单独培养的MMECs,标记为NC组。通过共聚焦显微镜观察48h内MMECs摄取CAFs外泌体的情况。应用q RT-PCR检测各组细胞内miR-21的表达。利用CCK-8增殖实验、Transwell迁移实验、小管形成实验检测各组细胞的增殖、迁移和成管能力。6.调节miR-21表达对E-MMECs的影响分别向E-MMECs中转染mimic NC、miR-21 mimic、inhibitor NC、miR-21 inhibitor,依次标记为mimic NC组、miR-21 mimic组、inhibitor NC组、miR-21inhibitor组。另将未转染的E-MMECs,标记为NC组。应用q RT-PCR检测各组细胞内miR-21的表达。利用CCK-8增殖实验、Transwell迁移实验、小管形成实验检测各组细胞的增殖、迁移和成管能力。研究结果1.原代NFs和CAFs的分离与鉴定免疫细胞荧光结果显示,NFs中荧光强度弱,α-SMA、FAP几乎不表达,CAFs中荧光强度较强,α-SMA、FAP具有较高的表达量。Western blot结果显示,NFs和CAFs均表达α-SMA、FAP。且与NFs相比,CAFs中α-SMA、FAP显著高表达（p＜0.05）。综合以上结果,我们成功分离NFs和CAFs。2.调节miR-21表达对NFs活化为CAFs的影响q RT-PCR结果显示,与NFs相比,CAFs中miR-21高表达,差异显著（p＜0.05）。NC mimic、miR-21 mimic、NC inhibitor和miR-21 inhibitor成功转染进入NFs。Western blot结果显示,与NC mimic相比,miR-21 mimic显著上调NFs中α-SMA、FAP的表达（p＜0.05）。与NC inhibitor相比,miR-21 inhibitor显著下调NFs中α-SMA、FAP的表达（p＜0.05）。提示miR-21能够将NFs活化为CAFs。3.成功提取外泌体透射电镜观察可见提取的外泌体具有双层膜结构,呈茶托状。NTA结果显示,NFs外泌体粒径约为138.8nm,CAFs外泌体粒径约为127.2nm,均处于外泌体粒径范围内。Western blot结果表明,提取的外泌体高表达CD63和CD81蛋白,符合外泌体的特征。综合以上结果,我们成功分离外泌体。4.成功诱导并获得MMECs CCK-8增殖实验、Transwell迁移实验、小管形成实验的结果显示,MMECs比HUVECs有更强的增殖、迁移和侵袭能力。q RT-PCR结果显示,MMECs中肿瘤相关内皮细胞标志物TEM5和TEM7的表达显著高于HUVECs。ELISA结果显示,MMECs上清液中VEGFA的含量显著高于HUVECs（p＜0.05）。综合以上结果,我们成功诱导并获得MMECs。5.CAFs源性外泌体对MMECs的影响q RT-PCR结果显示,与NFs外泌体相比,CAFs外泌体中miR-21高表达,差异显著（p＜0.05）。共聚焦显微镜下可见,48h内外泌体时间依赖性的进入MMECs的细胞质中。q RT-PCR结果显示,CAF exo组细胞中miR-21的表达显著高于NC组（p＜0.05）,CAF exo-depl组与NC组相比无显著差异。CCK-8增殖实验、Transwell迁移实验、小管形成实验的结果显示,CAF exo组细胞的增殖、迁移和成管能力均显著高于NC组（p＜0.05）,CAF exo-depl组与NC组相比无显著差异。提示CAFs来源的外泌体miR-21可以转移进入MMECs,CAFs外泌体在调节MMECs生物学功能中发挥作用。6.调节miR-21表达对E-MMECs的影响q RT-PCR结果证实NC mimic、miR-21 mimic、NC inhibitor和miR-21 inhibitor成功转染进入E-MMECs。CCK-8增殖实验、Transwell迁移实验、小管形成实验结果显示,转染48h后,miR-21 mimic组细胞的增殖、迁移和成管能力均显著高于NC组（p＜0.05）,miR-21 inhibitor组细胞的增殖、迁移和成管能力均显著低于NC组（p＜0.05）。提示调节miR-21可影响CAFs源性外泌体对MMECs的作用,即CAFs通过外泌体miR-21促进MM的血管生成。结论1.miR-21可以诱导NFs活化为促血管生成的CAFs。2.CAFs源性外泌体miR-21通过调节MMECs的增殖、迁移和成管能力促进MM的血管生成。