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背景与目的:心血管疾病是当今严重威胁人类生命健康的最主要疾病,其中,动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）则是诱发心血管疾病发生发展最常见、最重要的病理基础。AS是一种非传染的慢性炎症性疾病,起始步骤通常是内皮细胞（Endothelial cell,EC）受损导致功能障碍,致使血小板和单核细胞聚集到内皮下,并释放包括血小板衍生生长因子（Platelet-derived growth factor,PDGF）在内的炎性细胞因子。各种细胞因子进一步刺激血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）去分化为合成型表型,促进VSMCs增殖迁移,并从中膜层移行至内膜层,从而加速动脉粥样硬化的发展。另外,VSMCs在晚期动脉粥样硬化斑块中是有益的,它可以稳定并防止纤维帽破裂。微小RNA（microRNAs,miRNAs）是一类长约20个左右核苷酸大小的内源性非编码RNA。miRNAs通过在转录后水平与靶基因mRNA3’-非翻译区（3’-Untranslated Region,3’-UTR）结合,诱导mRNA的降解或翻译抑制,实现对特定基因的沉默,从而对生物体内基因的表达起到精细的调节作用。已报道许多miRNA在心血管系统中表达,并参与调节血管平滑肌细胞的功能。miRNA-520c-3p是miRNA-520家族的成员之一,该家族在染色体上位于19q13.42。目前研究发现,miRNA-520c在各种人类癌症中发挥重要作用,包括弥漫性大B细胞淋巴瘤、乳腺癌、纤维肉瘤和肝细胞癌。对乳腺癌的研究表明,miRNA-520c可通过抑制CD44促进癌细胞在体外和体内的迁移和侵袭。miRNA-520c-3p通过下调NLRP3抑制先兆子痫中NLRP3炎性体激活和炎症反应。然而,miRNA-520c-3p在动脉粥样硬化和血管平滑肌细胞中的作用还未见报道。本研究的目的旨在探讨miRNA-520c-3p在血管平滑肌细胞和动脉粥样硬化中的作用。体外实验是在PDGF刺激下,通过干扰miRNA-520c-3p的表达水平,研究 miRNA-520c-3p 对人主动脉血管平滑肌细胞（Human aortic smooth muscle cells,HASMCs）功能的影响及其分子机制。采用生物信息学、miRNA pulldown和萤光酶素报告基因系统寻找miRNA-520c-3p的靶基因,并对靶基因进行功能分析和恢复实验以了解miRNA-520c-3p是否通过该靶基因发挥作用。体内实验是通过构建载脂蛋白E缺失型（Apolipoprotein E,ApoE-/-）C57BL小鼠的AS模型和尾静脉注射miRNA-520c-3p agomir的AS干预模型,观察分析动脉粥样硬化斑块的大小和性质,探究miRNA-520c-3p对动脉粥样硬化的影响。以期更好的理解动脉粥样硬化的发病机制,为动脉粥样硬化的预防和治疗提供理论基础。方法:第一部分通过CCK-8法检测PDGF-BB对HASMCs增殖的影响,采用Western blot法检测PDGF-BB对HASMCs收缩型标志蛋白calponin和合成型标志蛋白OPN的影响。采用RT-qPCR法检测PDGF-BB对HASMCs中miRNA-520c-3p表达的影响。通过脂质体瞬时转染 miRNA-520c-3p mimics 或 miRNA-520c-3p inhibitor 改变miRNA-520c-3p在HASMCs中的表达水平,然后进行一系列功能实验:采用MTT和 EdU 法,检测 miRNA-520c-3p mimics 或 miRNA-520c-3p inhibitor 对 PDGF-BB介导的HASMCs增殖的影响;分别采用Boyden Chamber和流式细胞术,检测miRNA-520c-3p mimics对PDGF-BB介导的HASMCs迁移和周期的影响;利用Western blot 法检测 miRNA-520c-3p mimics 对周期蛋白 cyclin B1、CDK1、PCNA和cyclin D1表达的影响。第二部分采用 RT-qPCR 和 Western blot 法检测 miRNA-520c-3p mimics 对 RelA/p65 mRNA含量、蛋白质表达、磷酸化水平及细胞核内含量的影响。采用miRNA pull-down实验,检测HASMCs中miRNA-520c-3p与RelA/p65是否发生直接结合;采用双萤光素酶报告系统,探究HASMCs中miRNA-520c-3p是否能直接结合RelA/p65 3’-UTR 区,RelA/p65 是否是 miRNA-520c-3p 的靶基因;采用 RT-qPCR法检测不同时间点放线菌素D（actinomycinD,ActD）处理的HASMCs中RelA/p65 mRNA的相对含量,分析miRNA-520c-3p mimics对RelA/p65 mRNA半衰期的影响。通过脂质体瞬时转染siRelA/p65抑制RelA/p65在HASMCs中的表达,然后进行一系列功能实验:采用CCK-8和EdU法,检测siRelA/p65对PDGF-BB介导的HASMCs增殖的影响;分别采用Boyden Chamber和流式细胞术,检测siRelA/p65对PDGF-BB介导的HASMCs迁移和周期的影响;利用Western blot法检测siRelA/p65对周期蛋白cyclin B1、CDK1、PCNA和cyclin D1含量的影响。恢复实验将 miRNA-520c-3p mimics 和 pcDNA3.1-RelA/p65 共转染入 HASMCs 中,进行上述一系列的功能实验,探究共转染miRNA-520c-3p mimics和pcDNA3.1-RelA/p65与共转染miRNA-520c-3pmimics和pcDNA3.1对HASMCs增殖、迁移和周期及相关周期蛋白的影响。第三部分将60只雄性8周龄ApoE-/-C57BL小鼠随机均分为四组:（1）正常饮食+对照组（Normal diet+agomir negative control,ND+agomir NC）,（2）正常饮食+实验组（Normal diet+agomir miRNA-520c-3p,ND+agomir miRNA-520c-3p）,（3）高脂饮食+对照组（Hight-fat diet+agomir negative control,HFD+agomir NC）,（4）高脂饮食+实验组（Hight-fat diet+agomir miRNA-520c-3p,HFD+agomir miRNA-520c-3p）,构建ApoE-/-C57BL小鼠的AS模型和联合尾静脉注射miRNA-520c-3p agomir干预的AS模型。通过RT-qPCR检测小鼠主动脉中miRNA-520c-3p的表达。通过HE（Hematoxylin-eosin,HE）染色来观察血管病变情况。采用免疫组织化学方法检测小鼠主动脉瓣切片中RelA/p65的蛋白表达,探究miRNA-520c-3pagomir对血管壁中RelA/p65表达的影响。采用酶标仪比色法检测小鼠血清中CHO、TG、LDL-C、HDL-C的表达情况。通过马松（Masson）染色来观察血管壁胶原纤维含量。通过组织免疫荧光（Immunohistofluorescence,IHF）染色PCNA检测血管壁中增殖细胞的含量。结果:第一部分CCK-8结果显示,PDGF-BB可以促进HASMCs增殖,且10ng/mL或20ng/mL PDGF-BB的促增殖能力较为明显。为明确PDGF-BB对HASMCs表型的影响,Western blot检测表型标志蛋白,结果显示PDGF-BB可增加增殖型标志蛋白OPN的表达,OPN的增加趋势在12h时较为明显;PDGF-BB可减少收缩型标志蛋白calponin的表达,calponin在各个时间点均呈现明显的递减趋势,5ng/mLPDGF-BB已足够减少calponin。RT-qPCR结果显示,PDGF-BB刺激可以抑制HASMCs中miRNA-520c-3p的表达,且10ng/mL PDGF-BB刺激HASMCs 12h时抑制效果最明显。MTT和EdU增殖实验结果显示,miRNA-520c-3p mimics能够抑制PDGF-BB介导的 HASMCs 增殖,而 miRNA-520c-3p inhibitor 则对 PDGF-BB 介导的 HASMCs增殖没有影响。Boyden Chamber实验结果显示,miRNA-520c-3p mimics能够抑制PDGF-BB介导的HASMCs迁移。流式细胞周期结果显示,miRNA-520c-3p mimics能抑制细胞G1期向S期的进展,同时使细胞阻滞在G2/M期。Western blot结果显示,miRNA-520c-3p mimics 能够抑制 PDGF-BB 诱导的 cyclin B1、CDK1、PCNA的蛋白表达,而不影响cyclin D1。第二部分RT-qPCR 和 Western blot 结果显示,miRNA-520c-3p mimics 显著降低了HASMCs中RelA/p65 mRNA和蛋白的表达,降低了磷酸化RelA/p65（S536）的表达,同时减少了细胞核中RelA/p65的含量。miRNA pull-down实验结果表明,miRNA-520c-3p mimics 对 RelA/p65 mRNA 的富集是对照组的 2 倍多,miRNA-520c-3p可以直接结合RelA/p65 mRNA。双萤光素酶报告实验结果显示,miRNA-520c-3p通过种子区直接结合RelA/p65 3’-UTR位点2,而不是位点1,说明RelA/p65是HASMCs中miRNA-520c-3p的靶基因。mRNA稳定性实验表明,miRNA-520c-3p降低了 HASMCs中RelA/p65 mRNA的稳定性,缩短了其半衰期。CCK-8、EdU细胞增殖和Boyden Chamber细胞迁移实验结果显示,siRelA/p65能够抑制PDGF-BB诱导的HASMCs增殖和迁移。流式细胞周期结果显示,siRelA/p65减少处于S期的细胞比例。Western blot结果显示,转染siRelA/p65可下调HASMCs中cyclin B1、CDK1、PCNA蛋白的表达。功能恢复实验结果显示,共转染miRNA-520c-3p mimics 和 pcDNA3.1-RelA/p65 可逆转共转染 miRNA-520c-3p mimics 和 pcDNA3.1对HASMCs增殖、迁移和细胞周期分布的抑制作用。第三部分RT-qPCR结果显示,注射miRNA-520c-3p agomir上调了小鼠主动脉中miRNA-520c-3p 的表达。HE 染色结果显示,miRNA-520c-3p agomir 能够减少 ApoE-/-C57BL小鼠的动脉粥样硬化斑块面积。RelA/p65的免疫组化结果显示,miRNA-520c-3p agomir可抑制小鼠VSMCs中RelA/p65的表达。miRNA-520c-3p agomir降低正常饮食组小鼠血清中TG的含量,但是没有显著影响小鼠血清中T-CHO、LDL、HDL的含量。Masson染色结果显示,miRNA-520c-3p agomir降低了小鼠血管壁胶原纤维的含量。PCNA组织免疫荧光结果显示,miRNA-520c-3p agomir减少了小鼠血管壁及斑块内PCNA阳性细胞数。结论:1.miRNA-520c-3p mimics抑制PDGF-BB介导的HASMCs增殖、迁移和周期进程,而miRNA-520c-3p inhibitor对细胞增殖功能和周期进程没有影响。2.miRNA-520c-3p 通过直接结合靶基因 RelA/p65 mRNA 3’-UTR 促进 HASMCs中RelA/p65 mRNA的降解,减少RelA/p65蛋白的表达。3.siRelA/p65抑制PDGF-BB介导的HASMCs增殖、迁移和周期进程。4.miRNA-520c-3p通过靶向抑制RelA/p65来调节HASMCs的增殖、迁移和周期进程。5.miRNA-520c-3p agomir可下调小鼠主动脉瓣RelA/p65的表达,减少小鼠动脉粥样硬化斑块面积、胶原含量和PCNA阳性细胞数。