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一:liquid-PRF和PRP对炎症状态牙髓细胞再生能力的影响【实验目的】富血小板血浆(Platelet-Rich Plasma,PRP)已经在再生牙科中使用了二十多年。但研究表明抗凝剂的使用限制了其再生潜力。液体富血小板纤维蛋白(liquid-PRF)的制备不使用抗凝剂,离心时间短,故作为液体材料被引入到临床应用中。本研究旨在比较liquid-PRF与传统的液体PRP对人牙髓细胞(h DPCs)体外生物学活性的影响,及研究在正常和炎症状态下,liquid-PRF对人牙髓细胞再生能力的影响。【材料和方法】本实验使用Transwell实验,划痕实验,增殖实验,碱性磷酸酶(ALP)染色及定量实验,茜素红染色和实时定量PCR实验,研究liquid-PRF和PRP对人牙髓细胞迁移,增殖和分化的影响。免疫荧光染色技术用于研究liquid-PRF对NF-κB(p65)核转位的影响,实时定量PCR检测白细胞介素-1β(IL-1β),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和核因子κB(p65)的基因表达。【实验结果】与对照组相比,PRP和liquid-PRF均能促进h DPCs的迁移和增殖。与PRP相比,liquid-PRF显示出更为显著的促进h DPCs迁移的能力。此外,与PRP相比,liquid-PRF培养人牙髓细胞后,其ALP染色、茜素红染色和基因(Col1a1,DSPP和DMP-1)的表达均显示出优势。LPS与人牙髓细胞共培养时,炎性环境显著降低人牙髓细胞的修复能力。当在炎症环境中添加liquid-PRF时,降低的牙髓细胞再生能力得到改善。liquid-PRF显著降低人牙髓细胞炎症标志基因(TNF-α,IL-1β和p65)的表达,此外,liquid-PRF还抑制h DPCs中p65的核转位(表明炎症减轻)。【结论】与PRP相比,liquid-PRF提高h DPCs再生能力的作用更为显著,且liquid-PRF减弱了由LPS产生的人牙髓细胞的炎症反应,并促进h DPCs分化及修复性牙本质的形成。二:富血小板纤维蛋白成分分析及鉴定【实验目的】富血小板的纤维蛋白(PRF)作为能够刺激组织再生的自体材料,已在临床上得到广泛应用。目前,已经提出的几种PRF最终的细胞数量及分布没有明确的定量及描述。本研究的目的是通过使用新方法定量各层血液中的细胞,来比较不同的市售离心机及各自的制备方案制备的PRF中细胞分布及含量的不同。【材料和方法】三种离心机:Intra Spin(Intra Lock)、Duo Quattro(Process for PRF)和Eppendorf。每个离心机上运行两种现有的制备方案:液体PRF和固体PRF(即Intraspin约700g,3分钟及12分钟;Duo Quattro约60g,3分钟,约200g,8分钟;Eppendorf为200g,8分钟,700g,8分钟)。制备完成后,依次将每毫升血液从离心管(抗凝管)的上层朝向管底部取出,连续获得样品中所有血液(10m L)。然后将10个样品进行全血细胞计数分析,量化每个单独血液层内的精确细胞数。【实验结果】本研究揭示了目前使用的离心机制备的PRF中细胞数量和分布的显著差异。Intra Spin制备的L-PRF(700g,12分钟)中大部分血小板和白细胞集中在白膜层,而在上4m L层内只检测到少量细胞存在。使用Duo Quattro离心机在低速和短时间条件下(200g,8分钟)制备的A-PRF+中血小板分布均匀,但白细胞的数量和浓度显著低于PRF。与Intra Spin制备的liquid-PRF相比,Duo Quattro制备的i-PRF(60g,3分钟)具有最高浓度的血小板和白细胞,但i-PRF收集的总体积少,白细胞和血小板的总量显著低于liquid-PRF。与i-PRF方案相比,Eppendorf离心机制备的液体PRF(200g,8分钟)中血小板和白细胞的数量和浓度都显著增加(约增加2倍)。此外,与前两种离心机相比,Eppendorf制备的固体PRF具有最大量及浓度的白细胞和血小板(与A-PRF+相比高达3.5倍),且更均匀地分布在整个PRF中。【结论】本研究利用新型定量方法精确检测现有离心机及对应的离心方案制备的PRF中细胞分布和数量,这种方法可以作为一种评价各种离心方案的新技术。三:浓缩富血小板纤维蛋白(C-PRF)的制备研究【实验目的】我们研究富血小板纤维蛋白(PRF)中细胞含量及分布时发现L-PRF(2700rpm,12分钟;约700g)中大部分白细胞和血小板积聚在中间层(白膜层),而与全血相比,i-PRF(800rpm,3分钟;约60g)中血小板和白细胞浓度仅仅略微增加。由此我们提出一种新的含有高浓度血小板和白细胞的液体PRF-浓缩血小板的纤维蛋白(Concentrated Platelet Rich Fibrin,C-PRF)。【材料和方法】使用离心机制备L-PRF和i-PRF,在红细胞层上方连续收集血液100ul每层(1.2ml即12层),并收集红细胞层下方3层(即300ul)。然后将每层样本进行全血细胞计数(CBC分析)。【实验结果】与全血相比,i-PRF的血小板浓度增加2-3倍,白细胞浓度增加1.5倍。虽然L-PRF上4ml层中几乎没有发现细胞,但在中间层(白膜层)发现了大量的血小板和白细胞,即红细胞层上方0.3-0.5ml有极高含量或比例的细胞(增加了80倍)。因此,我们提出在红细胞上方收集0.3ml和0.5ml液体作为可注射的浓缩-PRF(C-PRF)。虽然一般情况下,i-PRF能够将血小板数量增加约2.5倍,但我们证明通过获取0.3-0.5m L的PRF,血小板浓度可以轻松增加10-15倍(>2000-3000*109 cells/L)。【结论】i-PRF方案能够使血小板含量增加2-3倍并且白细胞增加1.5倍,而L-PRF红细胞上层0.3-0.5m L的液体(C-PRF)中含有的血小板和白细胞浓度比全血细胞浓度高10倍。该浓缩富血小板纤维蛋白(C-PRF)是获取浓缩血小板和白细胞制剂的更有效方法。